实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问为何我的 WB 压出的片子整张膜都发光？

我是金博士

1、转膜条件基本可以，一抗与二抗浓度均较高。建议：（1）先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测），用点杂交，用1倍TBS或PBS稀释二抗做不同的梯度，比如1：1000，1：2000，1：4000，稀释好后各取1ul点在NC膜上，RT干燥，加发光液，曝光，确定二抗的合适稀释度。二抗浓度高了HRP会把ECL中的底物消耗掉，在你加上ECL的时候会很亮，但是很快就会减弱了，首先要保证二抗的稀释度合适才

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问Western与RT-PCR的区别？

tao0129

这只是从不同的角度来分析，Western研究的是蛋白表达水平，RT研究的是转录水平，尽管二者都是研究基因表达的。但有一定差别，转录水平不完全等同于蛋白表达，因为它没有考虑到转录后调节的问题。但RT有一个好处，只有有序列就可以做，不象Western必须有抗体。并且RT可以研究同一基因不同亚型的表达，而同一蛋白亚型通常有多种基因型。选择哪一种须根据你的目的而言，能两种都做当然好，但有时候也会出现不相一

2 回答2034 围观

问cDNA 产量的很低是什么原因啊？该怎么办？

tao0129

可能的原因：1.RNA模板质量低。2.对mRNA浓度估计过高。3. 反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足。4.同位素磷32过期。5.反应体积过大，不应超过50 μl。

2 回答1323 围观

问某一孔荧光信号特别强是怎么回事？

tao0129

原因：1. 试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多。2.试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同。3.也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染。

2 回答585 围观

问PCR引物的设计原则是什么？

赵栋2012

1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。2. 引物长度一般在15~30碱基之间。3. 引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。4. 引物3′端要避开密码子的第3位。5. 引物3′端不能选择A，最好选择T。6. 碱基要随机分布。7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。8. 引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。9. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。10

1 回答1607 围观

问固定在玻片上的细胞在保存后能否再用？

tao0129

如需要，可将有固定化细胞的玻片放在70%的乙醇中，-20℃保存2周。

1 回答1202 围观

问为什么会产生弥散（smear）条带？

tao0129

原因：在PCR反应体系中第一链产物的含量过高。解决办法：1.减少引物的用量。2. 优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数。3. 在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。

1 回答4374 围观

问PCR 实验的扩增曲线为什么呈现直线型？

tao0129

原因：1.探针部分降解。探针降解原因：（1）探针反复冻融――稀释的探针可在4℃保存至少3个月，应避免反复冻融。（2）探针在光线下暴露时间太长。2.反应液中有PCR抑制物。

1 回答1449 围观

问PCR 时变性时间 15s 退火时间 15s 是否会对结果产生影响？

丁香通官方号

引物与PCR大小无关，基本上引物在20-30 bp。

1 回答1868 围观

问扩增产物滞留在加样孔中了怎么办？

tao0129

1. 有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。2. 另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。

1 回答1411 围观

问请问一抗和二抗孵育条件如何比较？

tao0129

1.一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1~2 h，而4度过夜和从冰箱拿出后37℃复温45 min。2. 二抗一般室温或37度30 min~1 h，具体时间需要摸索。

1 回答5280 围观

问扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅？

tao0129

1.最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系.2. 与反应起始时RNA的总量及纯度有关。3. 建议在试验中加入对照RNA。4.第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10。5. 建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSⅡ

1 回答2122 围观

问免疫组化中的血清封闭原理？

tao0129

封闭血清的原理主要有两点。第一是待检样本会非特异性的和蛋白结合，从而导致背景过高，因此可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合，从这点看，BSA和血清没有明显区别。第二是待检样本中可能会有Fc受体，可以和抗体恒定区结合，与抗体特异性无关，封闭血清中有抗体，因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间结合。BSA则无法封闭Fc受体。

1 回答7225 围观

问PCR后没有目的核酸条带？

小坏2012

1.看看你用的引物适不适合做cDNA的扩增，不要用扩增DNA的引物扩增cDNA。2. 拿到cDNA后做扩增之前，最好做一个阳性对照，看看你的扩增体系工作如何。3. 当然非常少见了，如果你的扩增体系工作的，就是说你的试剂都work的，那么就要考虑你的仪器是不是工作的，有时候PCR仪永久了不维修会有这种情况发生。

1 回答1110 围观

问为什么要使用基因特异性引物？

tao0129

GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；随机引物用于mRNA片段的逆转录。

1 回答2409 围观

问阴性对照或空白对照翘尾

tao0129

原因：1. 模板提取环境有污染。2. 模板提取操作有污染。3 试剂配制过程存在污染。

1 回答3202 围观

问DNA 纯度的判断根据 OD260/OD280 的比值判断，在什么范围是最佳？

小坏2012

符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6~1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。一般机器给出的比值是分子分母同时减OD320所得，你可以自己算一下OD260/OD280，如果在要求的范围内，说明你的OD320偏高，即可能有有机物污染，比如酒精未充分挥发。纠正一下，纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯的RNA应达到2.0，样品中如果含有蛋

1 回答3952 围观

问石蜡切片和冰冻切片的比较？

tao0129

1.要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。2. 冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果

1 回答4022 围观

问制作下层凝胶后，用异丁醇封闭，可否用其他代替，比如正丁醇或水？

我是金博士

正丁醇、乙醇都是可以的，我们以前就用过。水就不行了。

1 回答786 围观

问封闭血清的选择原则是什么？

tao0129

1.膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性。2.封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。3. 也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。

1 回答1816 围观

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