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问
蛋白放入-80之前还需要加蛋白酶抑制剂吗?
我是金博士
装冻存,避免反复冻融,尽快检测。不用加蛋白酶抑制剂
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问
从细胞提蛋白,浓度总是不高?
我是金博士
跑电泳染胶看看结果图可以放上来Bradford对很多东西比较敏感,比如urea
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问
WB 实验为什么会出现无目的条带?
我是金博士
膜上无蛋白,可能样品降解或者上样量太少了
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问
我用 CST 的 eNOS 一抗,RIPA(强)提取人脐静脉内皮细胞,做了几次了也一直没出来条带?
我是金博士
eNOS 这个不是很好做,呵呵内参做的很好?转膜后丽春红染膜了吗
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问
为什么 WB 实验的目的蛋白发的很慢,而且不太清楚?
我是金博士
1、发光慢,可以考虑换用Millipore的ECL2、15孔上样量有限制,大了会串孔
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问
WB 实验中二抗用 TBST 稀释液是否容易出现杂带?
我是金博士
1、稀释液可以放在4度,但是不建议超过一周2、回收的不能超过一周,如果超过一周放到-20冻存。我们都不回收的3、我们用BSA4、二抗还回收呢?我们从来不回收。为什么用TBST稀释会容易出现杂带?5、胶片比膜大6、用剪刀剪
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问
胶片定影之后显得有点暗,不够清亮是不是定影液的问题呢?
我是金博士
显影液的问题,10%与12%的胶跑出来的marker位置是不一样的。
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问
做目的蛋白时压出来都是白板,不知道为什么?会是目的蛋白的一抗有问题吗?
我是金博士
1、调整一下GAPDH一抗的浓度,试试1:10000,20000另外二抗也可能会带出杂带,你可以做一个不加GAPDH一抗,其他均加入的对照。2、这个不能直接断定一抗有问题吧,先确定你的系统是稳定再考虑一抗问题。
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问
WB 结果的内参非常好,既没有背景条带也亮,而目的就不行,不是没有条带就是背景很高,这又是什么原因呀?
我是金博士
1、任何一个公司的抗体都不是百分之一百的。我认为CST的抗体成功率是目前最高的2、表达量的多少可以看看文献3、CST说明书用的是什么细胞作为抗原呢?如果你手上有可以做个验证。看是否你做的细胞表达少
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2484 围观
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问
Western 经常出现白板,连内参都不出来?
我是金博士
缓冲液的pH值,注意调教一下pH计
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问
为什么用四氯萘酚和 DAB 结合显色后,出现非常多的非特异性条带,而且背景显色一片?
我是金博士
1、直接DAB显色不行吗?2、二抗好像效果不好哦3、先直接用DAB试试,另外确认二抗没有带出来非特异性条带
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问
显影时背景很黑,我就洗了两天膜,然后又显影了一次,这次是白片?
我是金博士
最好stripping一下,背景很黑的话需要调整一下二抗浓度。
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2759 围观
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问
SDS 凝胶上样缓冲液中样品不算体积吗?
2072 围观
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问
我在做Western Bloting时,加ddH2O稀释成,不知有影响吗?
1806 围观
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问
想保证上样量一致,那么调浓度时用什么溶剂稀释蛋白浓度呢?
5767 围观
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问
兔源和鼠源抗体在制作上有何区别吗?
2560 围观
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问
内参不显影,或者曝光30分钟才可见模糊的显影,请问是什么原因呢?
3600 围观
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问
WB看不到条带?
1703 围观
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问
虽然阳性样品能染出条带,但以前阳性质粒也没做出来,可能不会是转膜时间问题?
1 回答
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问
内参一直就几个样本条带清晰明显?
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