实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问跑WB无法跑出满意的条带，怎么办呢？

府宅

1. 注意孵育、终止时间如果想得到漂亮的梯度条带，无论是不同处理时间的样品，还是不同给药浓度的样品，在处理过程中都一定要严格按照设计的时间来孵育和终止，尤其是对于磷酸化蛋白，哪怕 1 秒也不要提前或耽搁。 2. 抑制蛋白降解这是样品制备中最需要注意的部分。抑制样品蛋白降解的方法主要有两种：(1) 使用蛋白酶抑制剂小编使用的是罗氏公司（Roche）的蛋白酶抑制剂 Cocktail 片剂，效果不

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问wb实验中预制胶和梯度胶各有啥优缺点，如何选择?

府宅

预制胶只能分离其分离范围内的蛋白质，过大过小都不行，而梯度胶则不存在这种局限性，大分子在顶部分离，小分子在底部分离；由于梯度凝胶孔径逐步变小，在蛋白质不能通透的孔径附近对蛋白有浓缩作用，所以电泳后形成很窄的区带，可以分辨出分子量相差较小的蛋白质，而这类蛋白往往在固定胶无法完成分离。预制胶优势：1.电泳时间短，可支持150V电压，30-45min即可完成电泳过程2.边缘效应弱，条带更平直；于 Tri

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问哺乳动物表达系统主要用于制备哪种蛋白？

dxy_gwrp7ndq

已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子 VII 、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素III，集落刺激因子等。

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问动物组织需要最少重复多少次wb?

dxy_gwrp7ndq

WB实验，收样的时候可以不用做复孔，分装蛋白的时候可以分几份跑胶，也可以就跑一次。但是结果至少重复3次（三批的样本）保证重现性

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问背景杂质多，封闭液用了也效果不佳，有没有好的办法?

府宅

膜过度曝光，以及不足的漂洗都会导致高背景。将膜曝光的时间缩短. 同样的，不充分的漂洗只是需要将冲洗更加充分彻底.，漂洗用来去掉过量的抗体.

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问大分子蛋白总转不出来，该如何调节电泳条件?

dxy_gwrp7ndq

过夜转膜对于大分子量的蛋白还是很不错的，做了370KD的蛋白，100mA过夜18-20h即可

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问条带总有杂带如何破?

dxy_gwrp7ndq

杂带原因：1. 抗原的蛋白水解分解。这种情况并不少见，特别是如果样品储存时间过长，或者在起始组织均质化后分离蛋白质或膜。所有附加条带的表观分子量均低于全长蛋白质。特别易感的是突触蛋白和突触结合蛋白。应考虑添加蛋白酶抑制剂，如 PMSF、胃蛋白酶抑制剂或亮抑酶肽。2. 每条泳道蛋白质过多或检测系统过于敏感。蛋白质免疫印迹法中，凝胶过载是“鬼带”的常见原因之一。固定的蛋白质可以提供一个集中的吸附表面，

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问如何组织样本蛋白防降解？

dxy_gwrp7ndq

在提取时应保持低温状态并加入对应的蛋白酶抑制剂蛋白样本建议加入上样缓冲液煮沸变性后保存，对于稀有样本建议-80℃分装保存，并且避免反复冻存，尽快完成实验

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问如何防止组织样本wb蛋白提取时候降解？

府宅

1、使用蛋白酶抑制剂抑制细胞或组织中释放的蛋白酶活性。PMSF是廉价但高效的抑制剂，因此几乎是所有WB实验中必选之抑制剂。2、提取蛋白时，避开蛋白酶的最适活性温度。所有的步骤都可在低温下完成，所有的试剂都需预冷，以降低蛋白酶活性，防止蛋白降解。尤其是消化系统相关的组织样品尽量取新鲜的样品制备，制备方法选用液氮研磨的方法，将样品降解降到最低。3、加快提取速度。对于组织来说，取样顺序最先取消化系统相关

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问蛋白质的提取方法有哪些？

府宅

1、凝胶层析法凝胶层析是运用碳分子筛功效对蛋白开展分离出来。疑胶是具备三维空间多孔结构多孔结构的物质，历经适度的水溶液均衡后，装进层析柱。一种带有各种各样分子结构的试品水溶液迟缓地流过凝胶层析柱时，大分子物质不容易进到疑胶颗粒物的微孔板，只有遍布于颗粒物中间，因而在过柱时向下移动的速率较快，最开始被过柱。小分子水物质除开可在疑胶颗粒物空隙中外扩散外，还能够进到疑胶颗粒物的微孔板中，过柱时向下移动的

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问临床实验室蛋白定量质谱方法的准备有哪些？

府宅

1.基于Label Free的定量蛋白组分析2. DIA/SWATH定量蛋白组分析3. SRM/MRM/PRM蛋白相对或绝对定量分析

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问重组载体转化大肠、菌p后送测，结果(十个碱基突变)两个氨基酸突变。老板叫换个cDNA模板再做一次，结果二十个碱基突变，什么原因？

丁香粉猪猪

可能酶产物碎了一些，这样连进去就有大有小。如果你引物用的是在载体上的，那很可能扩出大小不同的。如果你引物就是在基因上的，这个好解决，你把退火温度逐渐提高，看看是不是那个不同片段就没了。 2、有的时候发生了片段自连【这个看起来好像很可笑，但其实我发现只要末端有一个碱基配对，时间长的话，片段是可以连接到一起的，这个就跟TA连接实际一样】。 3、你的电泳系统有污染，你把别人的片段给收进去

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问跑出来的条带有不是特异性的一条而是两条挨得很近的条带，是因为抗体特异性不好？

whilt-shirt

好几种可能，你可以更换抗体试试。

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问构建重组载体转化大肠后测序，序列总有突变，可以从那些方面分析原因？

bamboopiggy

首先把你的模版拿去测序，我遇到过因为模版有问题，结果怎么改条件都不行。2.如果实在不行，设计引物，把突变的地方再给它突变回来。我当时就是发现模版也有mutation，只能自己给它纠正回来

3 回答811 围观

问做qpcr的时候要有什么操作注意事项

dxy_gwrp7ndq

1. 用于qPCR反应的RNA应避免DNA的污染，RNA提取和反转过程中应小心谨慎。2. 操作过程中避光，冰上操作。3. cDNA模板避免反复冻融，否则会引起模板的降解。4. 模板量不足或降解将导致CT值出现过晚或者不出现。对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起。

3 回答878 围观

问如何取微小组织进行WB？

Amor良

可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。

6 回答619 围观

问薄层色谱法点样应该注意些什么？

举个栗子ok

样品溶液浓度不能太稀，同一板样点间距离合适。

4 回答1873 围观

问使用同一种trizol试剂盒提取RNA，条件也一致，但产量总是不稳定。是因为每次加试剂量有差异，导致离心时没有甩干的缘故吗？

vae1476

你的样本每次是否一样呢，如果需要排除一下条件，可以每次加入一个质控样本，进行对照

3 回答434 围观

问血细胞吞噬实验总是失败，荧光染色后没有发现吞噬现象

vae1476

细胞吞噬实验对细胞活性和状态要求很高，需要进行细胞活力考察

3 回答457 围观

问跑蛋白的时候，蛋白条带很黑，请问如何解决？

vae1476

抗体特异性不高会导致这种情况，另外提高封闭时间有利于解决

7 回答1511 围观

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