实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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细胞

问蛋白样品可不可以反复溶解？

小暮

最好不要反复冻融蛋白样品在制备后建议分装，用多少，拿多少

4 回答478 围观

问两步法和一步法有何优劣呢？在什么情况下要选择其中一种有没有要求？

bamboopiggy

其实这个要看你的实验目的，单纯的要跑realtime pcr，一步法，两步法都可以。但是如果想同时拿cdna做别的实验，就用两步法。先得到cdna，再跑realtime。一步法简单，省时间。两步法，稍微复杂，但是也不难做。

3 回答864 围观

问想要精确产量，怎么做RNA定量呢？除了买仪器还有什么方法吗？

bamboopiggy

可以将rna稀释，然后再去测浓度，一般浓度值在1000左右比较好。

3 回答405 围观

问最终PCR反应中假阳性结果，可能是RNA 中存在的基因组DNA，怎么去除gDNA呢？

whilt-shirt

现在有去除gDNA的逆转录试剂盒，可以试试

4 回答515 围观

问westerblot条带弯曲怎么办

bamboopiggy

胶配的时候，注意混匀。低电压，延长跑胶时间，跑胶的时候注意降温。

3 回答253 围观

问电极法测电解质中直接法与间接法的区别？

dxyv9281

1、ISE的直接法和间接法的区别在于直接法未作稀释直接测定,间接法预先稀释后测定,但是两种方法测定的都是离子活度.2、比较ISE法与火焰光度法之间是存在偏差的，ISE法偏高，造成这种差异的原因是：火焰法测定的是血浆中的钠、钾浓度；而电极法测定的是血浆或是血清水中的钠、钾浓度。电极法摒弃了样品中蛋白质和脂类等大分子所占体积，也就是称为基质效应，导致了电极法的结果偏离。对于ISE法中的直接法与间接

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问实验条带为什么会出现断带或者比较特殊的条带?

bamboopiggy

最大的原因可能是转膜的时候没转好，有气泡，或者胶因为太热而变形了或者胶破了。当然也有可能是加抗体的时候，没把膜全部浸泡。或者running buffer有问题，胶配的不匀。

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问新买的蛋白溶解液一般用什么DD水吗

小布丁瑶瑶

还是用灭菌的ddH2O好些。用TE后续试验不方便，同时，EDTA会螯合Mg2+，对后续PCR扩增不好！

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问蛋白跑胶比较淡，考虑蛋白浓度稀释，怎么浓缩蛋白

lyang556

常用的是透析浓缩，可以用透析袋。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋结扎，把高分子聚合物如聚乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将装有蛋白液的透析袋放入配好的30％－40％浓度的吸水剂中。

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问跑western blot的时候同一个抗体同一个细胞系或者组织，出现条带数不一致的原因

dxywode

条带位置异常可能是蛋白出现聚体或被修饰，蛋白出现降解有关。

3 回答1115 围观

问蛋白浓度测定除了BSA方法，还有没有其他方法？

天一湖医者

还有紫外吸收法，双缩脲法，BCA方法，Lowry法，考马斯亮蓝法，凯氏定氮法等

4 回答585 围观

问蛋白稀释梯度一般怎么设定

府宅

用考马斯亮蓝法时，稀释蛋白的倍数主要取决于标准曲线的情况。

3 回答723 围观

问蛋白纯化常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象，怎么解决？

桐轩456

首先我们要知道包涵体形成是因为外源性重组蛋白在高表达时，由于蛋白折叠辅助因子不足，在蛋白折叠之前分子间连接的疏水表面暴露在外面，导致折叠中间体大量堆积，并且这些中间体对蛋白酶的降解有抑制作用；对于大量折叠错误蛋白的出现，重组细菌体内缺乏相应的反应机制来恢复蛋白的正确折叠；促进细胞表达的蛋白多肽的溶解和正确折叠功能的丧失；蛋白或多肽自身结构在热力学和动力学上失衡；一些环境因素(如高温、酸性介质)能明

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问免疫荧光实验目标蛋白的荧光很弱，导致组间差异并不明显，造成假阴性结果是什么原因？

府宅

通过文献等查找一下目标蛋白在该组织或细胞的表达丰度如何。若该蛋白本身表达就很少。如果抗体修复不充分，抗原表位未完全暴露，也会出现弱标记现象。比如，尽管大多数抗体都是在酸性环境中修复，但是也存在少量的抗体需要在碱性环境中修复，建议查看抗体说明书，严格按照其修复条件进行实验。

3 回答503 围观

问怎样提高蛋白质在醋酸中的稳定性？

天一湖医者

1、尽量在相对密封和无菌的环境下快速进行分离操作2、在生理温度和压力范围内完成分离纯化操3、慎用溶剂和酸、碱、盐类，使用前要进行详细的试验，确定最佳添加量和条件;4、钝化或抑制蛋白质分解酶类的活性;5、选择合适分离方法。如:凝胶过滤、离子交换、吸附层析、亲和层析、电泳、结晶等。

4 回答504 围观

问关于WB实验显色问题？

dxy_gwrp7ndq

做ECL的一抗浓度比DAB染色稀释10倍或20倍，适当缩短曝光时间，曝光前将膜上多余的ECL液空掉。

3 回答1767 围观

问免疫共沉淀实验的注意事项，外源IP为何只能正抓或反抓成功

府宅

1.抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。2.溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原

3 回答497 围观

问蛋白标记实验，无蛋白质的区域具有高背景，怎么分析

府宅

检测试剂中的蛋白质抗体与特异性抗原结合，同时非特异性抗原同时也会非特异的结合在固相上的空白区域，产生高背景

3 回答428 围观

问蛋白质电泳图谱精度怎么控制？

wuli猫宁

根据聚丙烯酰胺凝胶薄片上蛋白质电泳带的粗细、深浅和迁移率，绘制电泳图谱，并计算相似率。

3 回答295 围观

问PBMC与肿瘤细胞共培养时，PBMC要如何预刺激？如果是用CD28包被的话是怎么包被的？

dxy_gwrp7ndq

可以购买 life technology公司生产的 Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28 for T-Cell Expansion and Activation，货号：11131D，价格： 8011元/瓶。用这个试剂后就不用再包被单抗，也可以进行预刺激

3 回答1175 围观

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