实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问PCR实验什么情况下需要使用RNase H？

丁香清香

RNase H可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。当PCR实验RNA/DNA杂合体不能正常水解时，需要考虑使用

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问用cDNA扩增一个基因,总是扩增出带有内含子的片段，怎么办

丁香清香

1. 任何一个时刻，提取的RNA里有尚未完全加工成熟的mRNA.2. 不管是否去除gDNA污染，都无法改变事实。只有靠marker去寻找正确长度的片段克隆，才能有可能得到不含内含子的基因片段。3. 注意灯下黑，如果测序引物位点离正向引物太短，正向引物可能不完整或有模糊碱基。

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问怎么保存酚不被空气氧化？

小露娜i

加入巯基乙醇和8-羟基喹啉至终浓度为0.1%。8-羟基喹啉是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制Dnase的活性。用Tris PH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，也可以往瓶里充入氮气，防止与空气接触而被氧化。然后保存在4℃或-20℃冰箱中，可以保存几个月不会变色。

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问为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戌醇？

dxy_9n80neqq

在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容光焕发器数次，加入异戌醇能降低分子表面张力，减少在振荡时气泡的产生；配比一般是氯仿与异戌醇为24：1，也可以采用酚，抽提DNA去除蛋白质时，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合(1：1)使用

3 回答434 围观

问提取RNA前，发现Buffer GTC有沉淀物，怎么办？

天一湖医者

如果在加入异丙醇之后就有沉淀，这肯定是蛋白质。也可能是无机盐沉淀，什么碳酸钙之类的因为，不溶于水，又不溶于75%的乙醇。

3 回答417 围观

问测序结果中有时候为什么找不到引物序列? 

Eason老歌迷

用PCR引物作为测序引物进行测序时，所测序列是从引物3'末端后第一个碱基开始的，所以自然就找不到您的引物序列了。有两种方法可以得到您的引物序列。对于较短的PCR产物（<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互补序列。对于较长的序列，一个测序反应测不到头，因此就只能将您的PCR产物片段克隆到适当的载体中，用载体上的通用

3 回答2887 围观

问为什么有时DNA提取量比较少？有没什么办法解决？

Keven轩

用个质量比较好的进口试剂盒就行

3 回答890 围观

问瞬转和稳转，提的DNA有区别吗？

Keven轩

提的DNA经PCR及琼脂糖凝胶电泳后没区别，都有目的基因的阳性条带。一般像构建细胞系用稳转，想快速获得大量目的基因表达产物用瞬转

3 回答2455 围观

问求助HepG2细胞培养基背景里面黑点及条状物是什么啊，有没有什么办法去除😭

bamboopiggy

这些小黑点是细胞自己分泌的，因为hepG2 有点挑血清，血清不好，它就会分泌一些物质，状态就稍微差点。

3 回答2357 围观

问求活菌计数方法，在不借助仪器的情况下？

bamboopiggy

你是说活菌克隆的计数方法吧？不是单个菌的计数方法，你可以直接用笔在平板上点点来计数。

3 回答572 围观

问求各位大神解答？我的质粒浓度240纳克每微升，酶切后线性化载体条带就很弱，目的条带200bp直接看不到，这怎么解决呢？

n0y0j7

为什么要切这个？连之前不用看小的，大的切完全就行了。连之后筛选阳的直接测序啊

8 回答1002 围观

问要做乳酸菌膜蛋白差异分析，可是用了贝博的膜蛋白提取试剂盒感觉效果不好，问一下提膜蛋白的师兄师姐们，有没有好的提取膜蛋白的方法，谢

bamboopiggy

根据你的实验目的，你选一个要用的试剂盒吧，虽然我不能提公司的名字（要不就说我打广告），但是你应该可以搜到。对于这些比较细的实验，建议不要买国产的试剂盒，虽然便宜，但是做不出好结果。

2 回答587 围观

问糖蛋白都有哪些呀？有没有纯糖蛋白

bamboopiggy

糖蛋白是一种含有寡糖链的蛋白质，两者之间以共价键相连。其中的寡糖链通常是经由共转译修饰或是后转译修饰过程中的糖基化作用而连结在蛋白质上。糖蛋白多肽链常携带许多短的杂糖链。它们通常包括N-乙酰己糠胺和己糖（常是半乳糖或甘露糖，而葡萄糖较少）。我感觉你可能没有理解你导师的一声，最好去和你导师double check一下，你导师可能想让你表达一个蛋白，但是有糖基化修饰

3 回答451 围观

问养的DC细胞不贴壁，还有cd14+？

bamboopiggy

在第0天，对来源于一个白细胞单采术样本的细胞进行铺板，挑选贴壁2小时的单核细胞。将没有贴壁的细胞冲洗掉，贴壁的细胞在培养基中培养7天。在第5 天，将成熟化添加物分别加入到细胞（成熟的树突状细胞）或者不加入到细胞（未成熟的树突状细胞）中培养两天。通过流式细胞仪来测定未成熟及成熟的树突状细胞中CD80、CD83和CD86的表达。在第7 天，细胞表达了成熟的树突状细胞标志物CD80、 CD83

3 回答900 围观

问请问各位大神们，小白第一次做肠道组织免疫组化，重复师姐摸索的浓度，DAB染色30秒组织全部都变棕色，背景也很深，是抗体非特异吗？

bamboopiggy

没法放大看，但是但看这个图，感觉染的挺好的啊，你的蛋白在肠绒毛上皮细胞表达丰度非常高

3 回答678 围观

问请问这是什么原因造成的呀，好多杂带

天一湖医者

1）目的蛋白有多个修饰位点，本身可以呈现多条带，建议查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小2) 样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作3）杂蛋白多，建议处理目的蛋白4）抗体特异性不强，建议使用特异性强的抗体5）抗体孵育时间过久，建议减少抗体孵育时间6）二抗与抗原有交叉反应，建议选择合适的封闭物7）二聚体或多聚体存在，

3 回答196 围观

问wb实验制胶为什么老有气泡呢？如图气泡感觉是在胶和玻璃板之间（板子认真洗干净并且烘干了，图片脏是板子后边的架子）请各位帮帮忙。

bamboopiggy

如果确定玻璃板洗干净了，那就是玻璃板不平，你别用这块了，换一块。

3 回答739 围观

问目的蛋白趋势是什么意思？什么是内参齐？

bamboopiggy

目的蛋白的趋势，比如说你的对照组比你的实验组的蛋白表达量少50%，但是你每次做wb，不可能是做的结果一摸一样，可能这次少50%，下次少40%，只要有少的这个趋势就可以。内参，因为wb是半定量的，需要一个同样样品中的，不容易改变的蛋白，作为上样量的参考，一般都是选的管家基因：如：actin，gapdh等。

3 回答1938 围观

问蛋白跑成这样咋办，断断续续的，该怎么解决

bamboopiggy

不是跑胶的问题，是你转膜的三明治夹心没有弄好，有的地方转的不匀

3 回答207 围观

问5000多bp的载体和5000多bp的目的片段连接体系？

天一湖医者

一般情况下载体与片段的摩尔比建议为1:3。

3 回答776 围观

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