实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问哪些原因会导致产物的品质降低？

bamboopiggy

酶的特异性和有效性，模板的纯度，pcr反应液配制过程是不是都是在冰上，pcr仪是否好用。

3 回答368 围观

问如果对RT产物进行电泳，理论上电泳图会是什么样的呢？

汤姆卜丽波

应该是和普通pcr差不多的图，可能片段会大一些

4 回答297 围观

问如何提高荧光定量PCR实验反应的灵敏度与特异性？

bamboopiggy

这个主要取决于你rna提取的质量和你设计的引物的特异性。只要这两个要点把握住了，realtime的结果就不会差。

3 回答927 围观

问做多重PCR时，不同基因引物探针之间如何评价质量

bamboopiggy

你可以试试snapgene或者vectorNT，其实你按照引物设计原则：普通的pcr引物设计的软件都可以用，只要使引物的退火温度接近，引物长度应最好 18~24 个碱基。退火温度和循环数非常关键。要尽可能提髙退火温度，要确认每一对引物单独扩增时的退火温度，然后在多重 PCR 反应时采用最低的退火温度。同样，要采用最少的扩增数。

3 回答843 围观

问共聚焦40倍镜看dapi 整个细胞蓝色一片没明显细胞核染色效果。目的蛋白是膜蛋白二抗是红色，也是红色一片没明显细胞膜结构，为什

汤姆卜丽波

是不是看错了，一点都没有么，如果有一点，那就是没染好

4 回答3705 围观

问请问，谁做过fitc-dextran的细胞通透性实验，求实验方法与步骤

未来9

可以参照这篇硕士论文《基于PI3K-AKT通路探讨泽泻醇A改善脑微血管内皮细胞氧糖剥夺损伤的机制研究》和博士论文《LIPUS联合SonoVue对肾小球内皮细胞的影响及机制研究》通透性检测方法步骤如下：将细胞接种于含0.4 um 孔聚碳酸酯膜的6.5 mm Transwell小室，培养Sd至细胞融合，进行OGD 处理，再予以不同含药培养基复氧，CO2继续培养24 h。然后将上室培养基更换为含20 u

5 回答16550 围观

问如何确定动物实验的给药浓度？

bamboopiggy

4 回答2127 围观

问PCR特异反应出现假阴性（无扩增产物）现象：正对照有条带，样品无条带的可能原因

n0y0j7

正对照有条带，说明体系正常，唯一不同就是模板，提取浓度低，或者纯化不完全，含有抑制剂。

5 回答1051 围观

问没有CT值出现，可能原因有哪些？

天一湖医者

反应循环数不够一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45循环），但高于45个循环会增加过多的背景信号检测荧光信号的步骤有误一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号引物或探针降解可通过PAGE电泳检测其完整性模板量不足对未知浓度的样品应从系列稀释样本的zui高浓度做起模板降解避免样品制备中杂质的引入及

3 回答1680 围观

问实时荧光定量PCR扩人的线粒体基因设计引物进行个体识别是不是要分段设计引物？

汤姆卜丽波

肯定要分段的，基因太长了，要针对每一段设计

3 回答339 围观

问关于细菌PCR电泳时候选择内参问题

未来9

细菌的内参常选用16S ；内参表达稳定,所以选择这个基因为基础,做矫正.在相同细菌量上比较目的基因的表达才是可信的结果

3 回答1628 围观

问PCR产物需不需要凝胶纯化?

bamboopiggy

如果下一步要酶切，连接之类的，是需要纯化的

3 回答399 围观

问洗涤RNA沉淀倒上清时候，倒不干净，我可以用枪头吸吗？

Junego

可以，少量残留液用干净小枪头吸，不同样品之间记得换枪头。

6 回答551 围观

问如何选择多重荧光定量pcr的报告基团和淬灭基团，选择原则是什么？淬灭基团是不是一样比较好？

天一湖医者

根据荧光定量PCR仪荧光通道，选择适配的荧光基团，优先选择常用的荧光基团，如FAM、VIC或CY5等；2. 根据荧光基团类型选择淬灭基团。早期的淬灭基团TAMRA，自身会发出荧光信号，干扰检测结果，后续慢慢地被其他淬灭基团替代。目前淬灭基团最常用的就是BHQ、NFQ-MGB或QSY等；3. 进行多重qPCR检测时，每个通道要选择不同的荧光基团，且避免各标记基团的激发和发射波长重叠，出现荧光干扰的情

3 回答6503 围观

问进行PCR实验，SSⅢ与SSⅡ有何不同？

bamboopiggy

SSIII 是一种基因工程化的 MMLV 逆转录酶 (RT)，它通过引入几个突变来降低 RNase H 活性、延长半衰期和提高热稳定性。 SSIII RT 提供更高的 cDNA 产量、更长的 cDNA 长度、更高的 GC 丰富靶 RNA 效率，以及比野生型 MMLV 和 MMLV RNase H-minus 酶更好的整体性能。SS II也是一种基因工程化的 MMLV 逆转录酶 (RT)，与野生型

2 回答674 围观

问PCR中关于cDNA的一点疑问

balalaLy

cDNA一般很少出问题，除非反复冻融次数太多，条带越来越淡有没有可能是你的酶出现问题了？酶反复使用过程中没有注意低温操作也容易成问题

6 回答2660 围观

问大家有没有扩长片段基因（16000左右）的酶和体系的推荐呀？

天一湖医者

这是最常规的PCR，随便用哪家的酶都可以。

4 回答478 围观

问以片段为模板扩增会导致产物品质降低吗

汤姆卜丽波

是会低一些，但是我们也有这样扩增过，还是能扩出来的

5 回答340 围观

问pcr实验，模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异？

社恐的阿宝

模板与引物之间解链温度的差异越小越好，越小效率越高

4 回答331 围观

问有杂合位点，但是出现杂合信号的位置上只出现单一的信号，出现这种情况可能是什么原因造成的？求指点，十分感谢。

未来9

如果在您认为应该出现杂合信号的位置上只出现单一的信号，那么可能是您样品突变的模板与正常的模板的比例没达到可以测出的浓度。测序反应的信号强度直接与模板的量有关，如果突变的模板所占的比例很低，仪器会自动将它作为背景信号了，很难检测出来。只有当测序反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时，才能较可靠地检测到突变体的存在。其次，在同一位置，不同碱基的信号强度一般是不一样的，这样即使突变的模板所占的比例较高

3 回答308 围观

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