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        qpcr溶解曲线异常

        相关实验:定量PCR技术

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        汤姆卜丽波

        qpcr熔解曲线中,NTC出现了扩增,CT值平均32,也没有污染,是怎么回事

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        8 个回答

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        Junego

        有帮助

        1.看NTC的熔解曲线是不是和目的基因的峰值有差异,如果不同,说明是非特异性扩增。也可以将产物跑电泳看看条带是否大小不同。

        2.如果1中熔解曲线相同,可能有气溶胶污染。看一下Ct值差异,如果NTC和目的基因Ct值差10以上,可以分析一下相对表达量。

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        秋秋欣欣

        有帮助

        NTC正常,NRC有Ct值,可能是RNA含有gDNA污染。建议用DNase I消化或使用含有gDNA去除的反转录试剂盒

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        飞来1988

        有帮助

        NTC有扩增,CT在32,需要根据溶解曲线峰值和样品孔峰值对比来判断产物是什么,如果样品孔两个峰,NTC一个峰,且是对应样本孔小峰值位置,那就是引物二聚体,建议降低引物用量或更换引物;如果NTC溶解曲线峰和样本溶解曲线峰完全一致,那就是有DNA污染,建议更换试剂,使用dna污染消除剂擦拭台面,移液器和pcr板等物品,使用带滤芯吸头,整个房间进行紫外灭菌和通风处理。

        user-title

        bamboopiggy

        有帮助

        是不是你的引物不特异?以前用过这个引物么?CT值32 在可以接收的范围内

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        Lovewn0929

        有帮助

        如果引入没有问题,只能说明模板含量较低,所以Ct值大,它量之间是反比关系。其次你再看看内参Ct怎么样。

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        天一湖医者

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        一般正常qPCR产物,大小在100-300bp之间,熔解曲线Tm大多在80°C以上,可能是引物二聚体导致,可进一步优化引物。

        user-title

        未来9

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        NTC有扩增,Ct值且<35,表示反应体系被污染,需要逐步排除污染源。

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        灵枢天问

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        如果确定不是污染的问题,那么NTC与目的基因的融解曲线峰应该是不重叠的。这种情况一般NTC的Tm值与目的基因的Tm值较低,主要是因为引物二聚体造成。不用管,不影响目的基因Ct值的准确度。

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