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问
对于pcr引物设计和荧光定量pcr引物设计的根本区别在哪里?
dxywode
一、方法不同1、普通pcr引物设计:引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。2、荧光定量pcr引物设计:通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,标记跟踪PCR产物进行实时监测反应,利用与之相适应的软件对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度二、原理不同1、普通pcr引物设计:为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。2、荧光定量pcr引物设计:在PCR反应体系中加入荧光基团
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问
做qPCR曲线出现异常?
whilt-shirt
有可能是模板浓度太高了,在基线期内就起峰了,仪器会默认起峰的线条仍为基线部分,将扩增曲线往基线位置下拉,因此你的曲线就趴下来了。这种情况大家也不要慌,可以减小基线终点(例如基线期默认 3 - 15 个循环,改为 3 - 10 个循环),重新分析数据,一般都能得到一个比较好的结果。
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问
DNA扩增的时候,PCR条带拖尾?
dxywode
拖尾在生物专业词汇叫做smear。造成此的原因有多种。一般来讲,有以下几点:1,引物设计不佳,造成了拖尾现象。2,PCR中DNA浓度加的太多,造成了拖尾。3,mg2+浓度加的太高,造成了拖尾。4,跑胶电压不合适,造成了拖尾。5,退火温度不合适,造成了拖尾。这些都可能造成拖尾,请认真分析之。谢谢。
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问
q-pcr验证高通量测序结果,结果为啥反复横跳?
汤姆卜丽波
这样的结果是不行的,三次独立重复的话。每次都要提RNA之后测浓度,必要时还要跑胶防止降解
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问
EP凝胶的聚合缓冲液是什么?
dxywode
琼脂糖凝胶电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE,而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。
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问
电转导质粒总是不成功?
dxy_g9y5gije
首先你考虑一下感受态细胞有没有问题,考虑转其它成功过的质粒尝试其次考虑一下其他转导方式比如说化学转导
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问
悬浮细胞做转染,lip3000,6孔板每孔种多少细胞转染效率比较高,现在种15万个细胞每孔,感觉转染效率不高
dxywode
如遇转染效果不佳,可采取优化方案对实验进行优化:1. 优化转染条件包括:转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间等等。2. 同时细胞污染也是造成细胞死亡,转染效率低下的一大原因。转染细胞用的质粒必须保证无菌。分享一个小秘诀:将提完质粒后或者提的最后一步,用75%乙醇沉淀,这样就除菌了。3. 转染用的质粒首先要保证数量,一般为2μg以上。如果质粒纯度不够或者含有细菌LPS或其他
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问
如何建立稳定铂耐药的卵巢癌细胞?是否需要先检测敏感细胞的IC50?检测IC50的规范操作是什么?
balalaLy
先检测IC50,再用比IC50高的大剂量冲击,接着用IC50的剂量维持一段时间,再重新测IC50
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问
关于gDNA基因组DNA
汤姆卜丽波
一般pcr.扩增模板浓度几ng到100ng都可以,普通的酶就可以扩出来,应该不是浓度的问题,跑之前确定一下模板没有降解,然后引物特异性和有效率
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问
imageJ处理WB条带时,为什么要去背景?去背景的原理是什么?
balalaLy
imageJ读取的是所选区域的灰度值,如果不去背景,会干扰读取值,结果偏差会很大
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问
染色体做完镜下看是实心的,像一个细的木棍
dxywode
只能是大概说一下,因为缺少图,其实你多看一些片子就会发现,做核型分析的时候,视野中出现的结构应该有分离良好的染色体,边缘很粗糙的圆形,边缘光滑的圆形大致三种类型。边缘粗糙的那种就是染色质在形成染色体的过程中。丝状的染色质盘绕在一起,是很难分开的,表现出来就是一个圆形的细胞核的样子。
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问
牛卵母细胞wb一抗好难找呀,买了几个都做不出条带 什么原因求大神指导!
汤姆卜丽波
可以看一看相关的文章,看看文章里的抗体是在哪里买的,问通讯也可以
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问
加尾法逆转录miRNA的qPCR如何区分前体和成熟体?
汤姆卜丽波
前体和成熟体的大小序列都不一样。除非你特别设计不同引物,不会一起扩增
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问
反转录同样按试剂盒建议量加,之后由SYBR染料法改为taqman探针法,结果曲线非常乱,不具有特异性,怎么改进
bamboopiggy
跟反转录和sybr的 关系不大,可能是你taqman探针法的引物有问题
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问
qPCR实验平行的孔总是重复性很差,该怎么改进呢?加样时有推荐的先后顺序吗?
balalaLy
每个孔加的量很低,要留意一下有没有把样品都完全打出去了,枪头上有没有残留
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问
半定量PCR和定量PCR在斑马鱼这类模式生物上的类似实验自己可完成吗?还是需要专业设备
汤姆卜丽波
就和其他生物一样操作就可以了,组织取核酸,不需要专业设备
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问
我想问下关于circRNA环状特性鉴定实验
bamboopiggy
1.RNase R消化检测 RNase R是一种来源于大肠杆菌的核酸外切酶,它可以沿RNA的3’-5’方向切割、降解RNA,能够消化几乎所有的线性RNA分子,但不易消化呈环形的RNA、套索结构或3’端突出末端少于7 nt的双链RNA分子。RNase R检测并非是必须的,但可以作为一个很典型的实验证明和鉴定circRNA。RNase R主要用于circRNA的鉴定和富集实验,需要根据具体的实验内容和
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问
跑荧光定量pcr 曲线有双峰,primer设计引物分数是满分,求大神给个建议。
balalaLy
如果是主峰前面出峰,一般是引物二聚体,如果是后面,可能是非特异扩增,可降低引物浓度,退火温度和镁离子浓度
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问
PD-1的流式抗体要怎么选择?
balalaLy
一种抗原就对应一种抗体(各种剪切体、修饰后的另说)
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问
培养液中病毒rna提取
天一湖医者
不同厂家的对比,可以参考一下选择。
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