实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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细胞

问RNAi载体构建

Eason老歌迷

RNAi载体设计与构建中设计过程如下：有研究以pCDNA3.1(+)载体为基本骨架,在其转录单元的5’端添加了一个自剪切的HDV核酶用于切掉转录后的5’帽子和其基因编码序列的3’端添加了一个自剪切的烟草环斑病毒发夹状核酶用于将3’polyA切掉,又在发夹状核酶下游添加了一个加尾信号BGHpA(牛生长激素加尾信号)。为了更加保险的防止通读现象的发生在BGHpA加尾信号下游添加了一个自我剪切的烟草环斑

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问A549细胞培养问题

天一湖医者

细胞出现空泡的原因很多,可以归结为细胞老化和衣原体感染两个主要原因。1.细胞老化。原代细胞培养的过程中经常出现这样的情况,是有些细胞处于终末分化状态,不会再分裂,时间长了就会空泡化而死亡。传代细胞出现这种状况比较少见,可能的原因是细胞代龄较长,老化严重。2.衣原体感染。一旦一些细胞出现空泡化,继续培养,空泡范围会扩大,即使传代后也如此,出现这种情况,细胞基本无法挽救。后来检测发现,此种细胞存在

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问谁做过人源MCSs成脂实验呀

天一湖医者

1.从单层细胞中收集MSCs；2.向6孔培养板的每个孔中加入2ml CCM，共有1&time105个细胞。最终密度约1&time103个细胞/cm2；3.将上排3个孔标记为“成脂”，下排3个孔标记为“阴性”；4.在37℃，5%CO2环境下孵育，每隔两天更换一次培养基，直到细胞达到7.%—80%汇合；5.达到所需的细胞密度时，从孔中吸出完全样机，向6孔培养板上排的孔中加入2ml FD

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问上游引物连微球

天一湖医者

这个要看引物长度较短，一般会降低扩增特异性，但会提高有效性，扩增的产物种。

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问akk培养问题。。。。求助求助求助

天一湖医者

液体培养基变浑浊的原因有以下几点：细胞受到损伤，细胞内容物外露造成的。培养基可能污染了，取部分培养基进行检菌试验

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问人群PCR分组计算怎么计算

bamboopiggy

这个需要每个sample计算自己的delta delta ct值，所以几百个人和一个人的算法都一样

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问NCT如果要测好几个基因，加哪个基因的引物呢？

bamboopiggy

NCT针对每个基因都要做的，所以你每个都要加

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问在跑完定量PCR后，如何处理相对定量数据？

Eason老歌迷

qPCR的数据相对定量分析其实很简单。分享一下自己的经验，最常用，最普遍的相对定量方法就是2^-△△Ct法，该法最最简单的说就是：首先将一次实验的所有基因Ct值整理好，之后用每一组样本自身的目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值，得到的数就是△Ct；换成公式就是：△Ct=Ct（目的基因）-Ct（内参基因）；然后，将每一组样本每一个目的基因的△Ct都算好，整理进Excel，用本次实验中待研究样本的△C

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问原核表达蛋白会出现包涵体，蛋白难以复性，那用真核表达蛋白要如何操作？

天一湖医者

在真核细胞中表达蛋白的步骤比大肠杆菌复杂得多。首先要考虑选用什么载体。一般趋向于使用分泌表达载体，以便于蛋白的纯化。但有的蛋白并不适合于分泌表达，如一些胞质蛋白，非糖基化蛋白等。此外分泌表达的蛋白信号肽存在一个效率问题。有的蛋白即使存在信号肽，也不能分泌。并且有的分泌蛋白较易受到蛋白酶的降解。所有这些因素都需综合考虑。1、克隆选用合适的内切酶把外源基因克隆于表达载体的多克隆位点。如果选用的是分

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问重组蛋白从细胞实验到动物实验

Eason老歌迷

如果研究对象是新化合物或者一些未知剂量的药物等，给药剂量必须在做药理之前确定。我们可以首先确定化合物的毒性，一般可以通过急性攻毒14天（毒理将在后续展开），设置药物梯度浓度，确定化合物安全的给药剂量，例如10mg/kg~100mg/kg；于是我们在该剂量范围内再设置梯度浓度，用几只动物造模确定药效以及药效剂量的关系，大概能够确定EC50（有效中等浓度）。正式实验时，以EC50为中等浓度，上下各设置

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问测细菌OD600，培养后不明显

Eason老歌迷

加硫酸镁重悬，然后浓缩到相应的倍数，再测，

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问大佬们，请问我这huh7细胞状态咋样

Eason老歌迷

长的还行啊，别长的太满啊，80%左右你就可以传了

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问HDF细胞

Eason老歌迷

考虑几点原因，一个是你复苏的过程有没有操作失误，二个是你传代的时间有没有把握好。

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问LO2细胞培养

天一湖医者

从图片看。是老化了，但是也有污染。

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问跪求：鼠原代血管平滑肌细胞VSMC经验？

天一湖医者

鼠原代血管平滑肌细胞1）取材：颈椎脱臼处死小鼠，在75%乙醇中浸泡2min，用眼科剪镊依次打开胸、腹腔，暴露心脏；10mL注射器抽取无菌PBS约10mL，连接在1mL注射器针头上穿刺左心室，冲洗主动脉。完整分离主动脉，放入35mm平皿中，加入2mL PBS缓冲液。在体视显微镜下小心将血管周围的结缔组织去除，使用显微弹簧剪沿主动脉纵轴剪开动脉，用显微镊子小心分离动脉中膜层并移入另一个含有2mL含20

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问求助：购买的原代细胞想自己鉴定，鉴定的时间是什么时候？复苏后吗？

bamboopiggy

复苏后，换液一次后。收集测定就可以

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问用raw264.7诱导破骨细胞，加rankl 100ng/ml, m-csf 50ng/ml,诱导9天，trap 染色

天一湖医者

收到细胞后：内含的纸条上建议马上/尽快传代，换新的培养瓶和培养液。我的经验是直接将细胞放到培养箱中适应环境数小时或过夜。

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问DNA杂交实验中的解离问题？

天一湖医者

可能已经降解了,严格进行操作吧.

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问请问大家肽类物质可以做网络药理学吗

Eason老歌迷

可以啊，我刚查了一下，不少这方面的文献。

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问硝化细菌噬菌体

天一湖医者

噬菌体具有体积微小,结构简单和严格的寄生性,必须在活的宿主细胞(如细菌)内繁殖,对寄生的宿主细胞表现出高度特异性,通常能将宿主细胞裂解,为一类属于病毒的微小生物,称之为噬菌体。其实际意义是可根据噬菌体寄生宿主菌细胞的高度特异性,并使其裂解这一特点用于细菌鉴定,亦可用于流行病学调查时的细菌分型。

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