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问
曝光总是条带附近背景很高是怎么回事?
天一湖医者
抗体浓度过高。如果使用过高浓度的抗体,它们可能与印迹膜发生非特异性结合。 这将导致整个印迹的均匀高背景。
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问
蛋白大小为40k左右,应该选择什么标签
天一湖医者
蛋白纯化首选His-Tag,Western blot首选Flag-Tag,免疫共沉淀可选择Flag-Tag或其他常用标签如HA、cMyc,活细胞成像则应该选择荧光蛋白等。
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问
在薄层分析等电聚焦的方法中,有哪些方法可以进行pH 梯度测定?
天一湖医者
等点聚焦电泳的测定pH梯度的方法有四种:1. 将胶条切成小块,用水浸泡后,用精密pH试纸或进口的细长pH复合电极测定pH值,然后作图。2. 用表面pH微电极直接测定胶条各部分的pH值,然后作图。3. 用一套已知不同的pI值的蛋白质作为标准,测定pH梯度的标准曲线。4. 将胶条于-70℃冰冻后切成1mm的薄片,加入0.5ml 0.01M KCl,用微电极测其pH。
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问
免疫组化和WB操作可以用同一种抗体吗
天一湖医者
如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。
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问
PCR实验结果发现目的蛋白无CT值是什么原因
天一湖医者
原因:反应循环数不够 一般都要在35个循环以上,可根据实验情况增加循环(如至45循环), 但高于45个循环会增加过多的背景信号检测荧光信号的步骤有误 一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号引物或探针降解 可通过PAGE电泳检测其完整性模板量不足 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的zui高浓度做起模板降解 避免样品制备中杂质的
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问
WB样本扩散了,怎么办
Eason老歌迷
是不是你的上样时间太长了啊,上样一定要迅速。。你同时跑几块胶呢?既然已经扩散了,那么就赶紧调高电压,跑完看看吧,不行就在跑一次吧
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问
免疫组化和WB可以用同一种抗体吗?
天一湖医者
可以,如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。
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问
上下槽缓冲液有何要求,怎样才能达到最佳效果?
天一湖医者
无特殊要求。但一般是上槽放新鲜的缓冲液,下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。
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问
我做的蛋白质分子量很小(10KD),请问怎么做WB?
天一湖医者
1)可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜,转膜时间缩短,另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系; 2)也可以选择PSQ 膜,同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起,再转移。其他按步骤即可。
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问
提取蛋白后浓度显示基本正常,但是转膜后丽春红染色看不到蛋白的位置,有marker,这是怎么回事呢?
天一湖医者
可能是转膜没转过去,或者转过了。你电转缓冲体系有问题,可以试着加点SDS,会好一点。
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问
在封闭之前膜需要漂洗吗?是用什么漂洗呀?
天一湖医者
不用洗的,封闭前后都不要洗,封闭后的更没有必要洗,因为我们的抗体就是用封闭液来配的。效果都很好!
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问
吉林中医药杂志投稿
天一湖医者
没有退稿,现在投稿审核都比较慢,慢慢等吧,
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问
甲状腺癌细胞不明原因干瘪死亡
Eason老歌迷
感觉是你的培养基不适合,或者是缺少了某个东西,ph值不对?
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问
中性粒细胞体外培养聚团
Eason老歌迷
可能有几个原因,一个是细胞离心速度过大或时间太长。或者是你消化不完全的时候,细胞和细胞之间的连接没有分开;消化过度的时候,圆形的细胞容易聚堆,再分开很困难。可能是状态不好、老化的细胞。或者是传代时没有吹打均匀,细胞团多。
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问
抑菌率实验求助
Eason老歌迷
一般不用。早期的血清制备中的滤膜的孔径大于0.22um,不能有效的去除支原体的污染。热灭活可以去除支原体的污染。但是现在血清制备中的终端滤膜的孔径为0.1um甚至小到0.04um,所以血清中一般没有支原体的污染。
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问
Western blot实验时背景高且不均匀怎么办?
天一湖医者
封闭物用量不足,提高封闭浓度,使用适当体积保证孵育时完全覆盖。转印膜封闭物使用不当,检测生物素标记的蛋白时,不可用脱脂奶封闭。封闭的时间不够,延长封闭时间,抗体非特异性结合减少,抗体的浓度和孵育时间抗体浓度过高或洗涤不彻底,降低抗体浓度,增加洗涤时间和次数化学显色底物过多减少显色底物用量
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问
qpcr要测RNA浓度吗orz
秋秋欣欣
需要,逆转录的时候需要根据浓度计算加样量
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问
玻片测试时容易起雾,有好的方法吗?
天一湖医者
把盖玻片泡进酸性液体中,或者可以将盖玻片按压在平面木头上来回摩擦。于是雾便轻易地被木头磨掉了。而且不用担心盖玻片是不是会被刮花,因为玻璃的硬度大于木头。
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问
免疫荧光一定要用共聚焦显微镜看吗?
秋秋欣欣
普通荧光显微镜也是可以看的啊。
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问
慢病毒液一定要浓缩吗?
一条咸鱼_
要,通常需要浓缩病毒颗粒以获得高滴度,特别是需要感染大量细胞或者用于某些对转导具有抵抗力的细胞系时。
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