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实验问答

25,334,530 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问鼠源肝癌细胞H22稳转接瘤

Eason老歌迷

我的师姐就是用的我的用KM小鼠接种的腹水好像也是用在BALB/C上的，挺好的，这个不影响吧。我还直接用腹水离心以后用生理盐水清洗离心，然后体外培养的，都没有什么特别的不一样。我估计你的传代细胞有问题，没什么活性，所以长不起来。

1 回答331 围观

问小鼠成瘤后瘤子大小形状各异怎么办？

Eason老歌迷

不是所有的肿瘤都能够长的均一，形态规则的，我做了8年的肿瘤模型，接触过三四十种瘤株，能够体积均一，形态规则的瘤株不是太多。所谓肿瘤生长至一定大小是指的平均值，不可能每一只肿瘤都是一样大的，关键是控制SD不能太大，一般SD为平均值的1/3算正常，1/4就很漂亮，1/5那是极品了。一般构建肿瘤模型，裸鼠主要保证周龄，周龄小一点好。

2 回答1224 围观

问coip加入beads之后要mix和wash，是直接用枪吹打好还是用vortex好？

dxy_o38ns7o8

枪吹比较好，涡旋振荡力太大容易破坏结合力阳性率降低

3 回答444 围观

问高分子材料水凝胶包埋蛋白，计算包封率时，游离的蛋白如何定量比较准确？

Eason老歌迷

我用的是差量法。蛋白质投加量减去洗涤液中的蛋白质含量（即没有包埋进去的蛋白质）。测蛋白的方法--分光光度发，我知道的有两种。一种是修正的Lorry法，另一种是考马斯亮蓝法。我用的Lorry法。

1 回答589 围观

问请问细胞长满一个T25瓶时，大概能铺几个6孔板，使每个6孔板的孔中达到合适的试验细胞密度？约每毫升10的5次方个细胞？

Eason老歌迷

一个T25的细胞瓶相当于6个培养板。铺6孔板得看接种密度和铺几块板，如接种密度为每毫升10的5次方，每孔加2毫升，一个25平方厘米的培养瓶可铺4块6孔板。

3 回答13628 围观

问原代神经元培养过程中聚团脱落是为何

申东熙老伯

贴壁不牢是一种可能，是因为细胞污染。操作过程注意一下。再就是可以细胞放到培养皿的时候可以少加点培养基，在培养箱培养个三十分钟等细胞完全贴壁再加足培养基。

3 回答410 围观

问免疫荧光双染抗体选择

Eason老歌迷

应该是没问题的。选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的。

4 回答531 围观

问为什么很多实验以丁酸盐处理小鼠，但是测小鼠粪便都测丁酸呢

Eason老歌迷

使用丁酸盐处理小鼠是因为丁酸盐是结肠细胞能量来源，促进小肠粘膜合成，酮体合成促进小肠细胞增殖、分化、成熟。测小鼠粪便测丁酸，是因为肠道微生物群的这些变化随后导致丁酸等保护性SCFAs的产生增加，进而触发显著的抗氧化、抗炎和屏障增强程序，从而减轻肠道炎症和损伤。

1 回答611 围观

问过滤器膜是怎么选择的呢？

Eason老歌迷

首先要考虑化学相容性，即滤膜是否耐酸、碱、有机溶剂等。常用的微孔滤膜一般是圆片滤膜，比如25mm圆片微孔滤膜，可以配合针头滤器连接注射器使用。47mm圆片微孔滤膜，可以使用换膜滤器，布氏漏斗、压力容器等配合真空泵，

4 回答678 围观

问我细胞传代不需要离心，只需要吹打成细胞悬液之后弃去部分液体，补加培养液就可以，操作很简单我步骤都是对的但是为什么我细胞状态一直？

Eason老歌迷

可能有几个原因，一个是你的传代时机选的不好，容易细胞老化。二是你的培养基缺少某些成分，或者是ph值不对。或者是你的胰酶消化过度。

3 回答1018 围观

问做WB实验时遇到高背景、多条带的情况怎么办？

sophomore

首先，高背景，可能是封闭液不是新配制或者可能有其他问题，最好重新配制封闭液，5%BSA或奶粉，商品化的封闭液都可以。而多条带有出现杂带的话一般先考虑有没有抗体特异性的问题，或者是与非目标蛋白结合后，会出现杂带可能。

8 回答2048 围观

问请问一下大家，最近在做GST pull down试验，发现GST也能将我互作蛋白的his拉下，是什么原因呢？

bamboopiggy

是单纯的his？还是你的互作蛋白耦连了his？如果是耦连的，当然要跟蛋白一起被拉下来啊。

2 回答704 围观

问elispot是不是要检测TB.细胞，需要分离培养淋巴细胞么？这个实验的前期基础怎么做呢

天一湖医者

elispot检测TB.细胞需要分离培养淋巴细胞。ELISPOT检测的是可释放细胞因子的活化T淋巴细胞的数目。ELISPOT方法的基本原理一样，但仍然会有一些变化，包括效应细胞的种类，可以是外周血T淋巴细胞，也可以是体外培养的T细胞。抗原刺激物可以是肽或者蛋白质，抗原呈递细胞有外周血单核细胞、树突状细胞或者肿瘤细胞系，检测的指标可以是各种细胞因子或者颗粒酶B等。

2 回答484 围观

问QPCR实验平行孔Ct值差别太大是什么原因？要怎样进行调整？平行孔之间Ct值要保证偏差在多少之间才可以，有标准么？

Eason老歌迷

ct值差别大，可能是模板浓度低或存在PCR抑制物，或者是你的pcr扩增效率低。Ct值的范围为15-35。Ct值小于15，认为扩增在基线期范围内，未达到荧光阈值。理想情况下，Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，也就是标准曲线。通过标准曲线，扩增效率为100%时，计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右，若大于35，理论上模板起始拷贝数小于1，可认为无意义。

5 回答1148 围观

问为什么显影时除了目的蛋白，背景中的其他蛋白也有些显影？

balalaLy

一个可能是抗体浓度高，适当降低一抗浓度，另一个可能是抗体用的次数多，重新配一支实在不行就得重新买抗体了

5 回答323 围观

问提蛋白的时候ripa和pmsf 的比例弄错了，弄成了10:1，

inventbiotech

没啥影响，就是有点浪费蛋白酶抑制剂

4 回答2606 围观

问实验技术丨求助考马斯亮蓝染胶结果疑问

inventbiotech

蛋白降解不像，降解成弥散装。70kd附近条带跟血清白蛋白很像，如果是组织样本可能是血清污染，如果是细胞样本，可能是培养基血清污染，对样本进行清洗应该可以去除污染。最下方是没有区分开的条带，可以用梯度胶进行分离，效果会好一些

3 回答769 围观

问WB为什么这么难做，一时有条带，一时没有

inventbiotech

WB其实也是一个很灵敏的蛋白检测技术。蛋白样品提取时产生的偏差会导致条带一时有一时无，尤其时目前大家常用RIPA来进行总蛋白的提取，当目标蛋白处于细胞核，细胞器，细胞膜上，这些蛋白在RIPA提取总蛋白时，细胞核因为裂解的不充分核不破或者是裂解特别大染色质打开样品粘稠核内一些蛋白依然不能释放，细胞器和细胞膜上的蛋白因为是膜蛋白脂质层包裹在RIPA裂解液中溶解度有限，尤其是跨膜蛋白这种问题就更为突出，

4 回答697 围观

问WB曝光后发现无目标条带，但内参条带比较好的原因有哪些

inventbiotech

这种情况可以说明WB操作没问题，需要考虑目标蛋白一抗，目标蛋白如果是外源性表达，需要找一下表达条件，载体。内源性表达，就需要考虑蛋白提取的时候是不是提取出来了，尤其是表达在细胞核细胞器和细胞质膜上的蛋白。提取时如果是用RIPA提取的，很容易将这些部位的蛋白丢失在RIPA的不可溶性组分里。还有一种情况就是这个目标蛋白表达丰度特别低，需要针对于所在部位进行富集再行WB检测

4 回答784 围观

问求助大家做WB电泳液和电转液重复使用几次

inventbiotech

电泳液内槽每次都是新的，外槽2-3次，电转液重复用不好吧

4 回答1671 围观

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