实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问求助：用ELISA检测细胞饥饿不同时间点酪蛋白的增加量怎么计算？增量如何变化？

Eason老歌迷

elisa检测最重要的是就是数据处理了。1. ELISA的样本通常要设置1~2个复孔进行检测，分别求出标准品、实验组样本的吸光度的平均值。单个样本的检测值不应超出平均值的20%。2. 样本的OD（吸光度）平均值要减去标准品浓度为0时的OD平均值。3. 建立标准曲线:在对数坐标图上拟合四参数的逻辑函数曲线（X轴上为标准品浓度，Y轴为对应的OD值）。推荐使用origin软件。

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问移植鼠瘤免疫组化可以用鼠抗人抗体吗

Eason老歌迷

我也做裸鼠移植瘤的，我老师说虽然是长在裸鼠身上，但它长的瘤子还是人的细胞长的，所以应该用人的抗体，因为细胞的基因型是人的基因型。

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问单克隆抗体和多克隆抗体怎么选？

天一湖医者

1，如果该蛋白在胞质或胞核中表达有多种存在形式，比如磷酸化和非磷酸化，而你需要检测的是其中磷酸化蛋白的，那么就要用单克隆的磷酸化抗体，如果你只是检测这种蛋白，是否存在，就可以用该蛋白的多克隆抗体。2，就是用了磷酸化蛋白的单克隆抗体，多克隆抗体也是必不可少的，因为你同样要使用多克隆抗体，跑个多克隆抗体的条带做对照，这样更能说明磷酸化抗体的表达和活化的情况，我认为这是必须的。并且我已经做的protc

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问诱导蛋白诱导不出来是什么原因，有什么可以诱导出来的方法吗？

天一湖医者

一是诱导条件不适合目的蛋白的表达，可通过改变培养基，温度，诱导剂等条件重新摸索出合适的诱导条件。二是目的蛋白的菌种有问题，可通过涂板挑选单克隆菌落重新培养，或者质粒重新转化表达菌株等方法优化菌种。

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问求助大神

dxy_az52pahw

如果程序温度过高，反转录的酶应该就失活了，建议重新配体系重新跑。

5 回答431 围观

问IMage pro plus无法显示计算面积

Eason老歌迷

去measure里面，找到count/size。里面“select color”选着颜色，即需要统计颜色的面积，可以直接使用corlor cube based 里面的吸管工具。例如这里统计白色的部分。记得选中预览模式，就可以看到选中的区域了。也就是图中红色部分会被统计，close回答上一个界面，进行计算，点击“count”。count之后没啥反应啊，是的，表面上看起来如此。其实是要去调出结果。过v

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问厚壁菌门与拟杆菌门

Eason老歌迷

就正常培养就行了，它两属于厌氧菌，

1 回答844 围观

问免疫荧光和HE染色的冰冻切片

Eason老歌迷

不行，不可以，少了一个步骤，你得固定

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问各位大神关于热激法转大肠杆菌的问题

Miracle星

建议换一批不要用放在-20的，要不不也白浪费时间？还不知道准确与否？

3 回答489 围观

问多巴染色的多巴孵育可以后续对切片进行孵育吗？相较于最开始使用孵育有什么大的差别吗？

Eason老歌迷

可以后续对切片进行孵育。相较于最开始使用孵育没有太大差别。

1 回答299 围观

问细菌定量荧光标记实验，加入钙黄绿素后直接发荧光，而不是等到细菌生长之后再发荧光来较快的提示细菌有没有生长，怎么调整实验？

Miracle星

检查一下，是不是步骤有不对的地方？钙黄绿素染色步骤1、用DMSO制备1 mM 的钙黄绿素溶液，并用PBS将其稀释制成1～50 μM的钙黄绿素溶液。2、将1/10细胞培养基体积的钙黄绿素溶液加入到细胞培养基中。3、在37℃培养细胞15-30分钟。4、用PBS或适当的缓冲液洗涤细胞两次。5、用490 nm激发波长，515 nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。a、如果钙黄绿素溶液很难进入细胞，可以

1 回答596 围观

问糖尿病心肌病怎么造细胞模型？

Miracle星

糖尿病心肌病造细胞模型1.实验动物 Wistar大鼠，120～150g，雌雄不限。2．实验方法高糖高脂饮食(10％猪油、20％蔗糖、2％胆固醇、1％胆酸钠、67％常规饲料)喂养4周，采静脉血进行空腹(禁食10～12小时，其间自由饮水)血糖(葡萄糖氧化酶法)、胰岛素水平测定，造成胰岛素抵抗后，于第5周开始每周行链脲佐菌素(STZ)腹腔注射[15mg/(kg·W)×4]，空腹血糖≥16.7mmo

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问为什么用His的抗体杂出了GST的条带？

小镇少年在学习

可以考虑换个his的抗体，his抗体也是识别HHHHHH，如果你目的蛋白里面有两三个连续的，然后抗体特异性又不好，也是可以识别的。

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问原核表达了目的蛋白融合蛋白88.3kDa，样品同时跑了两块SDS-PAGE一个做了考马斯亮蓝一个做了WB，但是WB条带很怪异

小镇少年在学习

第一建议Wb再重新做一下，弄个清晰的条带，方便确定蛋白是否表达。其次80多kd蛋白已经有点稍微大了，如果不表达，建议考虑真核系统

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问race实验中特异性引物如何设计？有没有什么判断标准？

Miracle星

引物设计使用锁定引物(lock docking primer)：在oligo(dT)引物的3′端引入两个简并的核苷酸MN（结构为5′-oligo(dT)16-30MN-3′，M=A/G/C；N=A/T/C/G）。使用锁定引物可使引物定位在poly(A)起始位点，消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位结合所带来的影响。3′RACE以3′末端的poly(A)序列

2 回答1251 围观

问WB计算出蛋白样品浓度后操作原理是什么？

inventbiotech

需要等蛋白量等体积上样，这样可以让跑出来的条带均一美观，后期蛋白量比较也更容易

4 回答530 围观

问收细胞样本时候看着很多，每组加30微升裂解液裂解细胞提蛋白后BCA定量蛋白浓度低，原因？

inventbiotech

如果是在板子里直接进行细胞裂解蛋白提取，样品很多是，裂解液粘稠糊在板子上会影响蛋白得率，板子上直接操作，还会存在因裂解液不强导致的细胞未被裂解，致使蛋白浓度过低。

4 回答547 围观

问目的条带时而清晰，时而不存在怎么办？一样的实验条件

inventbiotech

一时可以检测到一时检测不到，可能是样品在进行蛋白抽提时有蛋白丢失导致的，尤其是目标蛋白定位于细胞膜细胞器细胞核等位置上的蛋白，容易发生丢失。当然还有有可能是转膜失败，WB检测过程可以设置质控点，丽春红染色检查转膜是否成功。一步步分析看看原因出在哪里，如果是不是WB检测的问题，那就是蛋白提取的问题，如果是的话，建议使用柱式法总蛋白进行蛋白提取，可以解决这个蛋白丢失问题

4 回答163 围观

问WB内参还不错目的蛋白跑不出

bamboopiggy

首先要确定你的抗体好使，有阳参么？或者你可以试试孵育一个全膜，看看你的目的条带具体出在什么地方。

6 回答2821 围观

问为什么我跑了几次lc3蛋白，显影总是白膜一张?

bamboopiggy

lc3大概在17kd左右，您最好用15%的胶来跑，转膜时间控制在400mA，1小时就可以。

4 回答364 围观

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