实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问求问，对牛肉膏蛋白胨培养的细菌进行结晶紫染色后，为什么显微镜视野下会出现杆状物体

申东熙老伯

杆状物体可能是由于结晶紫沉淀，不要回收利用结晶紫，尽量吸上面的结晶紫染色。

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问悬浮细胞做免疫荧光如何贴壁

Dr_劉医生

都是细节问题！1. 爬片，一定要注意密度密度！！细胞不能太多，连成一片那种细胞很容易在 PBS 漂洗步骤大片脱落。其次细胞也不能太少，这样细胞也会被洗掉，拍照效果不理想。正常的细胞密度最好在 60-70% 左右即可，在显微镜下可以看到细胞一个一个的形态。有些细胞不容易贴在玻片上，会导致细胞形态和培养瓶内不一致，可以用明胶或多聚赖氨酸预处理一下玻片，再接种细胞即可；2. 固定固定，细胞长好后一定固定

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问免疫荧光实验爬片上的细胞每次根本都不能洗5min，特别容易掉，可能每次洗到最后，细胞都没了

Dr_劉医生

我的经验可能原因是细胞密度过高，特别是贴壁细胞，一团一团的，并不是很好的平面化，需要用枪头加细胞悬液给弄平，有个之前找的方法供参考。建议用10μl的小枪头吸取细胞悬液，在25mm的细胞爬片上从玻片外圈向内圈转圈加样，这么做相当于在缓慢加样的过程中，玻片上的细胞又完成了一次从外向内和从内向外的混匀过程，防止某一部位的细胞聚集。加样结束后，镜下观察细胞初步密度。如果细胞密度过大，可以将玻片上的细胞悬液

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问为什么细胞免疫荧光只能看到核，胞浆或者整个细胞的形态为什么看不到？

bamboopiggy

你核是用dapi染的吧？那个好显。然后看你的目的蛋白的位置是什么，然后选的抗体要好用。

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问测蛋白浓度时BCA标准品未稀释怎么办？

balalaLy

标曲是不影响的，但可以会影响你的蛋白浓度值的准确度，如果你的样品蛋白浓度很低，超出了标曲的范围，就会不准。

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问ip实验

Eason老歌迷

野生型细胞和过表达细胞系做的IP实验下拉下来的蛋白也不一样，会有差异的，建议你看看文献作参考。

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问求助大佬

Eason老歌迷

把细胞放入0.2%的PFA中，4°过夜，然后换成30%的蔗糖过夜(组织沉入瓶底即可)。放入OCT中包埋(需准备液氮瓶和包埋的小塑料盒)。切冰冻切片，-80°保存。取出切片，在室温中静置10min左右。切片放入0.2%的PFA中，冰上10min。用PBS+2mMMgCI2清洗，冰上10minX2次(500mlPBS+1ml 1M MgCl2)c将切片放入detergentrinse中，冰上10min

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问预测转录因子

Eason老歌迷

可以用JASPAR，也可以先用meme比对多个同源基因的启动子，找出保守motif，再用这个motif通过tomtom比对到一些已经发表的数据库，就知道可能结合的转录因子了。

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问cleaved-caspase1的western blot

balalaLy

cleaved-caspase1不好做，它的表达量低且容易降解，可以尝试做一个时间梯度

3 回答1836 围观

问大鼠鼻中隔在哪里

Eason老歌迷

两鼻孔中间就是鼻中隔啊。取材的话，就是可以先用剪刀将大鼠鼻部整个剪下来，然后从中间剪开，（有两个牙齿比较硬，有点难剪，要注意）。从中间剖开后，可以暴露整个鼻腔外侧壁，然后取鼻中隔即可。

3 回答651 围观

问细胞加药处理，发现药物作用窗很窄，药物加4小时，发现细胞碎了，还有必要做机制吗

Eason老歌迷

没必要吧。首先药物作用窗很窄，而且药物加4小时，细胞就死了。你这样后面实验很难开展。

3 回答467 围观

问求教抽提质粒后大小与预期不符。要的质粒大小在6000多bp抽提后4000多，浓度有400ng/ul，抽提了两次都这样是什么原因

bamboopiggy

你是酶切后跑胶还是质粒直接点的胶？如果质粒直接点胶的话，超螺旋的结构跑的比线性的要快。

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问20g小鼠卵巢组织切片该切成多厚的呢？

balalaLy

组织切片一般到6um以下就能够做出比较好的形态了，当然再薄一点也是可以的，只要你切得出来

5 回答1028 围观

问有大佬知道这是染了什么菌吗？

bamboopiggy

是真菌，不要在细胞间打开培养皿的盖子，拿出到外面hood里，加入84做无菌化处理

3 回答282 围观

问请问有人做snu387过表达转染用潮霉素的吗？急求一个药筛浓度参考，谢谢各位大神

bamboopiggy

我们的常用浓度是：hygromycin终浓度为80-160微克每毫升，你可以先加一个80，一个160试试，哪个死的多，但是能剩下一部分细胞用哪个。

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问HepG2细胞做cck8

bamboopiggy

可以考虑换用mtt试试，cck8如果你加的药物有强氧化性会和cck8 起反应的。

3 回答2498 围观

问求助！HepG2.2.15细胞怎么养

bamboopiggy

hepG2.2.15你按照普通细胞养就行，dmem高糖，10%的fbs，1%的双抗。就是血清选好点的。

3 回答538 围观

问制备单抗进行电细胞融合的时候，缓冲液的选择很重要吗？细胞不成串怎么解决？

Dr_劉医生

首先肯定buffer很重要，不然细胞融合和密度都有问题，如果商购专用的buffer按protocol来基本没问题；不成串的原因之一也是缓冲液不对，还一个两组细胞的比例得合适，看具体实验1：1，1：2都有。制备单抗的方法可参考方法学部分2.4（）Song G, Huang L, Huang Y, Liu W, Wang M, Hua X. Electrofusion preparation of a

3 回答421 围观

问巨噬细胞炎症模型

Dr_劉医生

3 回答1240 围观

问测组织匀浆中的ROS，空白对照的荧光甚至超过了实验组

balalaLy

以前我们课题组也用过这个牌子的，会出现这种情况，做多几次，确保不要出现实验过程操作上对细胞的影响

3 回答347 围观

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