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实验问答

23,120,731 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问我想问一下我做IP-ms后并没有检测到目标抗体蛋白，后面又做了IP-WB验证结果也是符合质谱的结果，这个是否能说明抗体有问题或者

赛默飞世尔科技

如果整个实验的操作步骤和实验设计没有问题的情况下，IP-MS和IP-WB结果都没有靶蛋白，说明目标蛋白表达量很低。但首先需要排除一下，IP过程中是否存在抗原结合水平低，抗原洗脱水平低等因素的影响。

4 回答1040 围观

问请问在Co-IP结果中，阴参也能IP下来是什么原因？已经增加了洗涤的次数，但是洗涤是颠倒混匀的。

土井挞克树

考虑是阴参受到了蛋白污染，或者抗体与某些组分非特异性结合产生了ip条带

3 回答429 围观

问在我做COIP时，经常会出现IP组蛋白表达甚至超过了INPUT组，是什么原因？

土井挞克树

考虑是抗体特异度差，没有特异性检测到目的蛋白导致的

3 回答2101 围观

问IgG也有目的条带，但是比实验组的IP样品弱，怎么办

土井挞克树

igG条带弱可能是由于裂解液中的去垢剂浓度太高或配方过于剧烈、蛋白与蛋白之间的相互作用太弱或不太稳定等原因导致。相应的举措有：1、降低去垢剂浓度或更换去垢剂种类；2、受蛋白的亚细胞定位影响，则新选择裂解液配方来释放目的蛋白；3、选择亲和力更高的抗体以捕获更多的目的蛋白，从而捕获更多的相互作用蛋白；4、选择目的蛋白或相互作用蛋白含量高的样品进行免疫共沉淀实验。

3 回答401 围观

问我想问下为什么我跑的input,Ip,IGg都有条带

赛默飞世尔科技

input和IP泳道条带可以根据分子量来判断一下是否为目的蛋白，igg泳道通常是会在25kd，50kd出现抗体轻重链干扰条带

3 回答3250 围观

问免疫共沉淀IP样品，洗不干净怎么办，

土井挞克树

可以用甘氨酸洗脱：甘氨酸洗脱1. 用10 mM的Tris-Cl缓冲液把Beads洗3次，3,000 g速度离心5 min，尽量吸尽洗涤液；2. 加入洗脱缓冲液（0.2 M Glycine, 0.15% NP40，pH 2.3），一般50 µL的beads 需加入75-100 µL洗脱buffer;3. 室温震荡洗脱 10 min；4. 2000 g离心2 min，吸取上清到新的EP管中；5. 重复

4 回答2744 围观

问洗涤液用TBS就可以吗，很多文献用什么NETN buffer

赛默飞世尔科技

不同的蛋白互做，其结合力是不同的。所以洗涤液不是通用的。常用PBS或TBS，如果出现非特异性条带，可以增加NaC l浓度，降低由离子静电引起的相互作用。或是加入低浓度的还原剂，打开由二硫键或亲和作用引起的结合。针对不同的样品，需要通过实验对洗脱液的成分进行优化。

4 回答2019 围观

问Flag beasds 拉下来的flag条带有拖尾现象怎么解决

赛默飞世尔科技

Flag条带有严重的拖尾现象，可能是蛋白发生了降解。每次操作好样品后快速至于冰上，离心保持4度。同时可以加一些蛋白酶抑制剂。

3 回答322 围观

问Co-ip ，如何避免下拉抗体的污染

赛默飞世尔科技

免疫沉淀复合物是三部分组成的，Protein A(G)凝胶，抗体IgG分子，目标蛋白。SDS-PAGE后，这些成分都会一起转移到膜上。当检测抗体与捕获抗体物种来源相同的时候，二抗会识别捕获抗体的重链轻链分子，导致出现55kDa重链带，20-25kDa轻链带的干扰。避免这些杂信号的影响呢？常见的方法有捕获抗体、检测抗体采用不同来源物种，使用针对检测抗体物种的特异性二抗；如果有可能，捕获抗体采用没有恒

3 回答398 围观

问某个基因已经敲除了，理论上蛋白没有表达，为什么还能拉下来蛋白

土井挞克树

可能是抗体特异度差，将杂质的结合误认为目的蛋白

3 回答3737 围观

问试剂盒去除不掉55的重链（频率很高）该如何解决

土井挞克树

可以在IP和WB实验中使用相同的抗体，如果目的条带在55kDa左右，可以通过选择与轻链特异性结合的二抗，来消除重链条带对目的蛋白检测的干扰。

3 回答256 围观

问我做了几轮gst pulldown 拉不出来蛋白。可能有哪些原因呀

土井挞克树

1.选取的细胞中互作蛋白表达量很低；2.样品中含有的非特异蛋白过多3.样品中没有相互作用的蛋白质；4.样品中蛋白质浓度过低，肉眼难以观测到差异条带；

3 回答1164 围观

问用于Co-IP的适宜蛋白浓度和含量有推荐吗

土井挞克树

蛋白浓度一般在2-5ug/ul，每次5-10ul

4 回答1314 围观

问免疫共沉淀（Co-IP）实验目的蛋白高背景产生的原因及处理方法?

土井挞克树

目的蛋白高背景产生的原因有很多种，比如：1.有非特异性蛋白结合2.转移膜上的非特异性吸附针对有非特异性蛋白结合这种情况，我们可以在无血清培养液中裂解细胞，而对于转移摸上的非特异性吸附，我们就要注意实验的操作问题，一定要戴手套，用镊子夹取，以及不接触转移膜转移面。

3 回答693 围观

问ip后蛋白分子量变化了（和input不在同一水平线上）是什么原因呢？

土井挞克树

首先要排除你的IP条带不是IgG的重链和轻链，再者排除你的一抗或者二抗没有污染，一般我们用新配的抗体理论上说IP的条带要和Input的一样。

3 回答5016 围观

问请问跑出来IgG泳道有和IP组一样目的条带大小的条带，且不是轻链重链的大小处，是什么原因呢？背景也很干净，没有杂带

loveliufudan

如果在免疫共沉淀（Co-IP）实验中，使用的IgG抗体出现与目的蛋白一样大小的条带，可能存在以下几个原因：免疫共沉淀实验中IgG抗体的浓度过高：如果使用的IgG抗体的浓度过高，可能会导致其在样品中非特异性地结合，从而产生与目的蛋白一样大小的条带。共沉淀的非特异性蛋白质：在样品中可能存在一些非特异性的蛋白质，这些蛋白质可能会与IgG抗体非特异性地结合，从而产生与目的蛋白一样大小的条带。良性异克隆：有

3 回答2565 围观

问flag beads 拉出来的flag条带有严重的拖尾现象是为什么？怎么解决？

土井挞克树

拖尾考虑是有样品裂解的问题，建议用新鲜的样品，最好是现煮现跑，不要过夜

4 回答1842 围观

问我跑出来的Co-IP，为什么IgG有很浓的条带

土井挞克树

ig G条带很浓可能是抗体特异性差的原因，建议更换特异度高的抗体

3 回答3796 围观

问请问IP抗体与IF抗体有什么区别？想做IP实验，但是没有目的蛋白的IP抗体，查了所有的公司，只有IF或者wb抗体，那么可以用IF

土井挞克树

不可以互用的，IF是荧光实验的抗体，Ip实验一定要用IP抗体

3 回答1497 围观

问（求助）大鼠CCD模型

loveliufudan

大鼠CCD模型的L形不锈钢棒通常需要根据实验需要进行定制，可以考虑以下几个途径：常规实验仪器供应商：大部分实验仪器供应商可以提供不同类型和规格的不锈钢棒，可以通过向供应商咨询和询价的方式了解相关信息。定制加工厂家：如果无法找到符合需求的标准规格不锈钢棒，可以考虑委托定制加工厂家制作符合实验需要的L形不锈钢棒。可以通过搜索相关加工厂家并进行询价等方式获取信息。个性化3D打印：使用3D打印技术可以根据

3 回答354 围观

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