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        PCR扩增法

        相关实验:含有目的基因真核表达 pEGFP-C1 载体的构建实验

        最新修订时间:

        原理

        以DNA为模板,在4种核苷酸存在的条件下,借助DNA聚合酶作用出现的酶促合成,依赖于在加热条件下,双链DNA解离成单链(变性),降温(复性),使引物与单链特异性结合,同时使4种核苷酸在DNA聚合酶的作用下,发生以引物为起点进行聚合的现象,使DNA链不断延伸,PCR反应进行。反应步骤包括:变性(常规采用94℃高温条件下使待扩增的模板DNA氢键断裂,解链成为单链模板)、退火(人工合成的引物在低温下分别与模板DNA单链形成杂交链)、延伸(在72 ℃条件下,DNA聚合酶将单核苷酸在引物3'端掺入,延模板3'→5'方向延伸,合成新的DNA链)。以上三步反应构成一个周期,每一周期产生的DNA均可成为下一个循环的模板,PCR产物以指数方式增加。

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1.  按下列组分配制PCR 反应液:
         
        PCR扩增法
                                                                                              共50 μl


        2.  PCR 反应条件
         
        95 ℃ 5 min
         
        95 ℃ 30 sec
         
        55 ℃ 30 sec 30 Cycles
         
        72 ℃ 1 min
         
        72 ℃ 10 min
         
        4 ℃ forever

        3.  琼脂糖凝胶电泳检测结果

        注意事项

        PCR 反应液在冰中配制,然后置于PCR 反应仪上进行PCR反应, 这样可增强PCR扩增的特异性, 减少PCR过程中的非特异性反应, 能得到良好的PCR 结果。

        来源:丁香实验

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