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        293T 细 胞 包 装 和 扩 增 反 转 录 病 毒

        相关实验：分子生物学实验

        最新修订时间：

        材料与仪器

        步骤

        基 本 方 案 1 磷酸钥/DNA 沉 淀瞬时转染 Phoenix 反转录包裝细胞

        材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 75c m 2组织培养瓶中处于指数生长期的包装细胞（亲嗜性或双嗜型；见辅助方案2) x/P B S 不含 C a2+ 或 M g 2+ 0 •0 5 % (m / T O 胰酶/0•53m m o l / L E D T A 完全培养基： D M E M ， 1 0 % (V A O 热 灭 活 的 F B S ， l O O U /m l 青 霉 素 ， l O O U / m l 链霉素， 2m m o l / L L -谷氨酰胺 50m m o l / L 氯 喹 （P B S 配制，一20°C 保存） V 2m o l / L CaCl2 1〜2 m g /m l 反转录载体质粒经C s C l 密度离心或者Q i a g e n 试 剂 纯 化 （图 14. I.1 和 图 14. 1.2) N/ 2 X H eB S ( H E P E S 缓冲盐）， p H 6.99 6c m 组织培养皿 15m l 无 菌 离 心 管 （加盖，可旋紧） JVotI(821) Ncol(6665) K I I1 ______ I pRSV V iI m p〇i 卜 朧 v _ 卜 2 Poiy(A) pRSVgpIRES-Lyt2 M?rt(818) Notl(2795) I PCMV ~ f e ). pCMundefinedEa iVcoI(818) Nco\2n5) Lpg- M Y -^)~ (，l J ----1 ¾ ¾ pCMundefinedEeco 图 14. I. I Phoenix反 转 录 包 装 所 需 的 质 粒 。 293T细 胞 稳 定 转 染 PRSVgpIRES-Lyt2载 体 。通过流 式 细 胞 仪 分 选 出 Lyt-2表 面 蛋 白 高 表 达 的 克 隆 ，命 名 为 Phoenix-gp (中NX-GP)。 Phoenix-gp克隆然 后 稳 定 转 染 其 中 一 个 包 膜 蛋 白 。通 过 稳 定 表 达 的 包 膜 蛋 白 筛 选 。利 用 pCMV# Ea和 pCMV# Eeco 质 粒 分 别 构 建 Phoenix亲 噬 性 （中N X -A )和 Phoenix双 嗜 型 （$N X -E )包 装 细 胞
        图 14. I.2 从 Phoenix包装细胞扩増病毒所需的一些标准质粒。不同的连接位点允许靶基因的克隆， 以 及 D N A 文库或者是肽文库的构建。其中一些质粒的稳定表达克隆通过G418筛选或者通过流式细 胞仪分选。 EGFP，增强绿色荧光蛋白； EMCV，脑心肌炎病毒； IRES，内部核糖体插人位点。 L 每 瓶 75c m 2培 养 瓶 的 P h o e n i x细 胞 用 IOml P B S 轻轻洗一遍。弃去 废 液 ，加 入 2ml 0.05% (m /V ) 胰酶/0.53m m o l /L E D T A ，置 室 温 5m i n 。快速拍打瓶底直到形成单 细胞悬液。加 入 15m l 完全培养基终止胰酶反应。 2•细胞计数（附 录 3A ) ，每 个 6c m 培 养 皿 中 加 人 3m l 完全培养基，含 2 X 106个细胞， 培 养 24h ，细胞汇合生长到8 0 % 。 3 . 所有的转染试剂在使用前放至室温。 4 . 每 个 6 c m 培 养 皿 加 入 4]u l 50m m o l /L 氯 喹 （加入转染试剂后终浓度为50]Ltmol/L )。 轻轻摇动平板，混匀。放人培养箱， 12h 内加入2 X H e B S 。 如 果 不 需 要 得 到 最 高 滴 度 ， 只 是 为 了 比 较 不 同 克 隆 的 相 对 滴 度 。 最 好 不 要 使 用 氯 喹 。 5. 1 5 m l 离心管中每管加入61/xl2m〇 l / L C a C l 2 ，然后用移液器将5/x g D N A 加在离心管 的管壁。再 加 入 434M 1 水 ，轻弹管壁使之混匀充分。 6 . 向 C a C W D N A 混合液加入0,5ml 2 X H e B S ，用手动调节移液器充分混合。 第 一 次 使 用 H e B S ， 最 好 确 定 沉 淀 形 成 最 佳 吹 打 时 间 （2〜20s)。
        7 . 用移液器把转染混合物逐滴加入氯喹处理过的6c m 培养皿中。相差显微镜下观察细 胞上面是否有沉淀物形成。 8. 37°C 培养 4〜8h 。 9 . 小心地吸去培养皿中的培养基，加 入 4m l 的新鲜培养基。培养至次日早上。 10. 再次更换培养基， 32°C 继续培养，这样可以降低细胞分裂次数，提高病毒颗粒的稳 定性。 11. 48h 和 （或） 72h 后 ，轻轻吹起细胞，收集反转录病毒上清。最好使用新鲜的上清 液感染，因为储存上清液的滴度会降低。 转 染 24h 后 ，包装细胞接近全部汇合生长。转 染 36h 以上才能得到高滴度的反 转录病毒。 72h 内 每 12h 收集上清避免滴度损失。 因此，必须及时补充新鲜培养 基 。假如反转录载体带有像G F P 和 (3-半乳糖苷酶之类的标记，感 染 后 48h 就可以 通过荧光显微镜和组织化学染色观察转染效率。整个系统优化后的转染效率达到 5 0 % 以上。 用新鲜的病毒上清感染受体细胞收获的反转录病毒滴度最高。如果上清不是在 几小时内使用，应当放置冰上。冻融一次，上清病毒的滴度会下降一半。 备 选 方 案 1 水 疱 性 口 炎 病 毒 G 蛋白的假型反转录病毒 注意：操 作 V S V - G 假型病毒体要非常小心。 V S V - G 假型病毒能把病毒体的感染 性传递给人细胞。而 且 V S V - G 假型病毒被用来表达已知的原癌基因，所以必须认真执 行正确的法规监督。 附 加 材 料 （其 他材 料 见基本方案 1) Phoenix-gp细 胞 系 （见辅助方案2) 水疱性口炎病毒G 蛋 白 （V S V -G ) 表达质粒：如 p M E -V S V G ，或 者 p H C M V - G 1. Phoenix-gp细胞铺板，转 染 （见基本方案1， 步 骤 1〜2)。 2 . 磷酸钙沉淀方法共转染5M g PM E - V S V G (或 者 p H C M V -G ) 和 5M g 反转录病毒载 体 ，用无菌双蒸水调节总体积为Iml (见基本方案1 ，步 骤 4〜10)。 V S V - G 表达载体带有非常强的启动子，例 如 Sra (p M E -V S V G ) 或 者 是 C M V 早 期 启 动 子 （p H C M V -G )。整合到包膜脂质双层的V S V - G 蛋白数量和细胞芽变产 生 的 V S V - G 蛋白呈正比。 3 . 收 集 病 毒 上 清 （见基本方案1，步 骤 11)。离心，一80°C 保 存 （见辅助方案1)。感染 前用细胞培养基1 : 100稀释。 辅 助 方 案 1 水 疱 性 口 炎 病 毒 G 蛋白假型反转录病毒的浓缩和低温储存 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 水疱性口炎病毒G 蛋白假型病毒Phoenix细胞的反转录病毒上清（见备选方案1) V T S E 溶液 0. 45]itm过滤器
        B e c k m a n L 系列超速离心机（或同等设备） B e c k m a n S W 4 1 或 S W 2 8 转 子 和 离 心 管 （7 0 % 乙醇清洗，层流净化柜中晾干） 1 . 用 0.45M m 过滤器过滤收集病毒上清，检测回收率。 2 . 转移到^土1仙11离心管中，用3界28或者3冒41转子4°(：， 50 0 0 ( ^ 离 心 3 ^ 小 心 倒 去上清，吸干剩余的液体。 3 . 用 1/100〜1/200原体积， 4°C 放 置 H 〜24h 的 T S E 溶液重悬沉淀。移液器轻轻混 勻 ， 一 80°C 保 存 4 个月。 辅 助 方 案 2 Phoenix细胞的培养 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) Phoenix 亲嗜性、Phoenix 双 嗜 性 和 （或） Phoenix-gp 细 胞 系 （http://w w w .stanford,edu/group/nolan/) 完全培养基： DMEM， 1 0 % (V A O 热灭活的FBS， 100U /m l青霉素， lOOU/ml 链霉素， 2mmol/L L ~谷氨酰胺 V 不含Ca2+ 或 Mg2+的 PBS 0 . 0 5 % (m/V ) 胰酶/ 0 . 5 3 m m ol/L ED TA 冻存液，冰上放置： 9 0 % 热灭活的FBS/ 1 0 % ( V A O 二 甲 基 亚 砜 ① M SO) 50m g/m l 匀霉素 B(hygromycin B ) ， PBS 配制 2m g / m l 白喉毒素，无菌水配制 75c m 2组织培养瓶 50m l 带盖锥底离心管 低速离心机 2m l 冻存管 冻存盒 1. 37°C ， 5 % (：0 2的细胞培养箱中，每 75c m 2组织培养瓶含20〜30m l 完全培养基培养 P hoenix亲嗜性、 P hoenix双 嗜 性 和 （或） Phoenix-g p 细胞。如 果 24h 后裂解细胞， 每瓶种植1.0X 107个细胞； 48h 后裂解细胞， 4.5X 106个细胞/瓶 ； 72h 后裂解细胞， 2 X 106个细胞/瓶 ； 96h 后裂解细胞， I X l O 6个细胞/瓶 。 2 . 当 细 胞 达 到 8 0 % 〜 9 0 % 汇 合 生 长 ，吸 去 上 清 ， 10ml PBS轻 洗 。弃 去 ，加 入 2ml 0.05%胰酶/0.53m m d /L E D T A ，室温消化5miri。快速拍打培养瓶直到形成单细胞 悬液。加 入 15m l 完全培养基终止胰酶反应。细胞计数并在培养瓶中种植适当数量的 细 胞 培 养 （步 骤 1)。 3 . 冻存细胞：当细胞达到8 0 % 〜9 0 % 融合 ，消 化 细 胞 （步 骤 2)，计数 ，移 至 50m l带 盖锥底离心管， 4°C ， 500g 离 心 3〜5m in。 弃去上清，用预冷的冻存液重悬，细胞终 浓度 为 4 X 106个细胞/m l。 一 瓶 长 满 有 I.5 X I O 7〜2. 5 X I O 7个 细 胞 。 4 . 每个冻存管中加入I m l 冻存液 ， 一 80°C 放置直到结冻，然后放入液氮罐保存。 5 . 复苏细胞： 75cm2组织培养瓶加入 20〜30m l完全培养基。从液氮罐中拿出冻存管，
        迅速放入37°C 水 中 ，不停摇动。用吸液器将冻存管中的细胞吸入含完全培养基的 75c m 2 培养瓶中，然后按照步骤1 和 2 培养。 注意： 做 好 脸 部 保 护 ，防 止 冻 存 管 内 液 氮 迅 速 气 化 而 发 生 爆 炸 。 6 . 重新进行药物筛选， 75c m 2培养瓶加入20m l 含 有 200m g /m l 匀霉素 B 和 2M g/m l 白喉 毒素完全培养基，细胞密度为5 X 105。 3〜4d 更换培养基。至少要筛选 1 周 。 推 荐 每 隔 几 个 月 都 要 用 药 物 进 行 筛 选 以 保 证 包 装 蛋 白 的 表 达 量 。 基 本 方 案 2 感染贴壁细胞 材料 N I H 3T 3 细胞 成纤维细胞生长培养基（F G M ) : 如完全培养基： D M E M ， 1 0 % (V /V ) 热灭活的 F B S ， l O O U /m l 青霉素， l O O U /m l 链霉素， 2m m o l /L L -谷氨酰胺 Phoenix产生的反转录病毒上清：亲嗜性或者双嗜性（见基本方案1 ) 或者假型病毒 (见备选方案1);新鲜收集或者冻融（见辅助方案2)，或 者 浓 缩 （见辅助方案1) 4m g / m l Polybrene (海美溴铵），或 者 5m g /m l 硫 酸 鱼 精 蛋 白 （ P B S 配制 ， 0.2M m 过滤， 4°C 储存） 6c m 组织培养皿 0 •45fx m过滤器 1•在6c m 培养皿加入3m l F G M ，加 入 2 X 105处于指数生长期的N I H 3T 3 细胞。 37°C ， 5 % C O 2培养过夜。 2 . 感染前，用 〇 .45M m 过滤器过滤新鲜收集的病毒上清。如果需要，室 温 ， 500g 离心 5m i n 除去细胞碎片和活细胞。小心吸取上清到新管中，尽量避免碰到沉淀。在病毒 上清中加入4m g / m l Polybrene (海美溴铵），或 者 是 5m g /m l 硫酸鱼精蛋白增加感染 效率。 3 . 吸 去 N I H 3T 3 的培养基，加 入 I m l 反转录病毒上清。继续培养2〜16h 。 如 果 有 需 要 ， 5〜 6h 内 每 小 时 用 新 鲜 的 病 毒 上 清 换 液 ， 可 提 高 转 染 效 率 ，特别 是 生 长 缓 慢 的 细 胞 。根 据 靶 细 胞 在 聚 阳 离 子 复 合 物 存 在 时 的 活 力 决 定 培 养 时 间 。 4 . 吸去反转录病毒上清，加 人 4m l F G M 。转 染 48h 后检测靶基因的表达。 备 选 方 案 2 贴 壁 细 胞 快 速 （spin) 感 染 （见 基 本 方 案 2) 附 加 材 料 （其 他 材料 见 基 本 方 案 2) 带有平板支架的Beckman GS-6K R 或者 是 Sorvall RT-3000B 离心机 1 . 在 6 孔板中加入I.5m l 含 I X l O 5处于指数生长期的NIH 3T 3 细 胞 的 F G M 培养基。 37°C ， 5 % C O 2培养过夜。 2 . 准备反转录病毒上清（见基本方案2 中，步 骤 2 和 3)。 3 . 吸 去 NIH 3T 3 的培养基，加 入 0.5m l 反转录病毒上清。用 Parafilm封口膜封住板 口，室温， 1200g 离心 I.5h 。 备 选 ：新 鲜 分 裂 细 胞 可 以 像 悬 浮 细 胞 一 样 直 接 重 悬 在 病 毒 上 清 （见 备 选 方 案 3 ) 。
        离 心 帮 助 细 胞 和 病 毒 的 立 即 接 触 。 4•撕去Pam film 膜 ，放 入 37°C 培养箱培养12〜20h ， 1.5ml F G M 换液 5 . 转 染 48h 后检测靶基因的表达。 备 选 方 案 3 悬 浮 细 胞 的 快 速 （spin) 感染 附 加 材 料 （其他材料见基本方案2) 处于对数生长期的Jurkat细 胞 （A T C C ) 完 全 培 养 基 ： R P M I -1640， 10 % (V A O 热 灭 活 的 F B S ， l O O U /m l 青 霉 素 ， 100U /ml链霉素， 2m m o l /L L -谷氨酰胺 Bec k m a n G S -6K R 或者是 Sorvall R T -3000B 离心机 2 4 孔板 32°C 培养箱 1 . 准备反转录病毒上清（见基本方案2 中，步 骤 2 和 3)。 2 . 室温， 500g 离 心 5m i n 沉淀处于对数生长期Jurkat细 胞 （5 X IO5个细胞/孔）。 3 . 每5 X 105个 细 胞 加 入 I m l 病毒上清，种 植 到 2 4 孔 板 中 。 Parafilm膜封好板口，室 温 ， 1200g•离心1.5h 。撕 去 Parafilm， 32°C 培 养 箱 培 养 过 夜 （12〜16h )。 不 同 细 胞 系 的 离 心 时 间 为 5min〜 1.5h ，每 次 增 加 15m in来 确 定 最 佳 离 心 时 间 。 4 . 次日收集Jurkat细 胞 ，室 温 ， 500g 离 心 5m i n 。 4m l R P M I -1640完全培养基重悬后 加 到 6c m 培养皿， 37°C 继续培养48h 以上。
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        来源：丁香实验

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