单链抗体的噬菌体展示技术

基本方案 1 全套单链抗体噬菌体载体的构建

材料

新鲜分离的小鼠脾脏或者 IO7 杂交瘤细胞（单元 undefined3)

R N A 提取试剂

R T -P C R 试剂

D E P C 水

寡核苷酸引物（表 14. 3.1)

DNA marker

琼脂糖胶回收试剂盒（Qiaquick Gel Extraction kit， Qiagen)

10m m o l / L Tris • C U p H 8. 5

Vent D N A 聚合酶

d N T P (由 R T -P C R 试剂盒提供）

P C R 缓冲液（由 R T -P C R 试剂盒提供）

噬菌粒载体（如 P C A N T A B 5E )
限制酶 S / il、及相应缓冲液

B S A

T 4 D N A 连接酶和 10X 连接缓冲液

电转感受态菌£：coli T G - I
S O C 培养基

Y T A G 琼脂平板： Y T 培养基， 2 X (附录 1 ) 含 0 . 4 % 葡萄糖， 100/xg/m l 氨苄青霉素

Y T A G 培养基： Y T 培养基， 2 X ，含和不含 15% (V A O 甘油， 100/xg/m l 氨苄青霉素

P C R 仪

I.5m l 微量离心管

电穿孔仪器

0.2c m 容器

13c m 无菌离心管

接种环

1 . 用 R N A 提取试剂盒提取脾脏或者细胞的总 R N A 。溶解在 0.5 ml D E P C 水中，作为R T -P C R 模板。剩佘的 R N A 分装成 50M 1/管，一 70℃ 保存。

2 . 根据 R T - P C R 试剂盒说明配制 4 管 48/xl 反转录反应体系，每管包含 20/xg 的总R N A ， 0. 5 ug oligo d T 。 95°C 孵育 I O m i n 后放于冰上终止反应。

3 . PCR扩增：每管加入下列引物混合物（表 14.3.1)，引物的终浓度为 50pmol/50ul反应体系，总体积为 2m l 。

管 1 : 引物Mu-VH1-6-BACK(引物 NO.1〜6，根据表 14.3.1 的比例混合）和引物M u -J H l - F O R (S ) (引物 N o .10)。
$管 2 : 引物 M u -V H l -6- B A C K (引物 N o .1〜6 , 根据表 14. 3 . 1 的比例混合）和引物 M u -J H 2- F O R (S ) (引物 N o .11)。管 3 : 引物 M u -V / d -7- B A C K (S ) ( 引物 N o .16〜22，根据表 14. 3. 1 的比例混合）和引物 M u -Jk I - F O R (引物 N o .32)。管 4 : 引物 M u -V k I-7- B A C K (S ) ( 引物 N o .16〜22，根据表 14. 3. 1 的比例混合) 和引物]\/[11-]^2卞01^(引物？^〇 ,33)。 1^-?〇尺试剂盒的一个反应体系包括1\?〇尺缓冲液， 0.2111111〇 1/乙〇 11^13， 1〜 2U 耐热 D N A 聚合酶。 4 . 扩增参数如下: 1 循环 Smin 95〇C 预变性 3 5 循环 30s 95〇C 变性 Imin 55V 复性 Imin 72°C 延伸 1 循环 5min 72〇C 产物延伸样品 4°C 保存。 5 . 取反应产物， 1 . 5 % 胶电泳。准备胶回收和重新扩增。如果没有得到满意结果，参考表 14.3.2。反应 1 和 2 产物为350b p ，而反应3 和 4 为 330b p 。注：表 14. 3. 1 列出的 M u -V H 7- B A C K (引物 N o .7)， M u -V H 8- B A C K (引物 N o .8)， M u -J H 3-F 〇 R (S ) ( 引物 N o .12)， M u -J H 3-F 0 R (L ) ( 引物 N o .1 5 ) 为 V h 的兼并引物。 M u -V k8- B A C K (S ) (引物 N o .23)， M u -V k： 8- B A C K (L ) (引物 N o .31)， M u -J K 3-F 0 R (S ) (N o . 3 3 ) 为 V k 的兼并引物。文库构建不需要这些引物，但当上述引物混合物扩增失败，可以考虑这些引物。这些引物导致抗体区末端发生突变，而这些突变会影响s c F v 的亲和力，所以不推荐。上述步骤中提到的引物不能通过R T -P C R 扩增出某些特殊杂交瘤时，建议先确定重链和轻链的N 端氨基酸序列以便设计相应的特异性引物。表 1 4 . 3 . 2 所有方案的疑难问题问题可能原因解决方法基本方案 1 第一次 PCR没有产物第一次 PCR有非特异性条带反转录或者PCR失败用阳性对照模板检测试剂盒及试剂 RNA模板质量不好或者参考 CPI单元 10. IlRNA 提取正确的工作条件降解和注意事项 PCR反应没有优化优化 PCR反应：MgCl2 浓度，复性温度，其他条件。如果其他条带不是很亮，问题不大，因为通过胶回收获得正确的PCR产物第一次 PCR产物条带弥散可能是引物和总RNA核苷从总 RNA中纯化mRNA，参考 CPI单元 10. 11，酸复性基本方案 8 组装 PCR产生的 scFv产量 PCR反应没有优化较低优化 PCR反应：MgCl2 浓度，复性温度，其他条件。同样的条件和引物扩增组装scFv$

$产物 4°C 保存。 14. 取 5M 1产物， 1 % 琼脂糖凝胶电泳（750b p)。 15. 胶回收P C R 产物，定量（步骤 6〜8)。如果 scFv D N A 为唯一的条带，可进行 P C R 回收，D N A 溶解在 50/^1 p H 7. 5 10m m o l / L Tris • Cl 溶液中。 16. 5U S / H 酶切 5M g 噬菌粒 D N A (如 p C A N T A B 5E ) 。 B S A 终浓度为 0 •l m g /m l 。 50°C 孵育 3h 后，加入 5U N 说I， 37°C 继续孵育 2h 。其中 N a C l 的浓度为 100m m o l /L o 17. 1 % 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。切取目标条带，胶回收，定量（步骤 6〜8)。 1 8 . 同步骤1 6 , 酶切 scFv。无菌水代替洗脱液进行胶回收， D N A 溶于 22M 1无菌水。 19. 配制连接反应体系（5 份）： IOOng S / zl+ A t o l 消化好的质粒D N A 8 0 ng S / il+ N o d 消化并纯化好的scFv 2 ^ 1 1 0 \ 连接缓冲液 Ijul T 4 D N A 连接酶双蒸水补充至总体积为20M 1。根据厂家推荐黏末端连接温度和时间， 16°C 或者 4°C 孵育 16h 。 20. P C R 回收连接产物，无菌水代替洗脱液，最后用50jlJ 无菌水溶解D N A 。 21. 制备电转的感受态菌E . c W T G l ( C P I 附录 3N ) 或者是商业化的电转感受态菌 T G 1，准备 2 0 个预冷的微量离心管，分别加入 100/^1电转感受态菌液 T G 1 ，放在冰上。有些电转仪已经有预先设置的程序，如果没有的话，参数应设为 2.5k V ， 25，， 20〇 n 〇 2 2 . 准备 2 0 管电转反应体系，每管加入2. 5； xl纯化好的连接产物和IOO1 Ltl电转感受态菌液。加样器轻轻混合，冰上放置40〜50s。 2 3 . 转移 D N A /细菌混合液到预冷的小槽内，立即放到电穿孔小室，冲击 4〜5m s 。取出小槽，立即加入900/xl预热到室温的 S O C 培养基。用移液器上下混合，转移到 2 0 个无菌 13m l 离心管。 37°C 持续振摇孵育Ih (25〇 r/m i n)。 24. 从每管中吸取10M 1液体。 1 0 倍梯度稀释，涂到含抗生素的Y T A G 琼脂培养平板上确定文库容量。 30°C 孵育 16h 。 25•每个离心管室温， 5000g 离心 10m i n ， lOOpl新鲜的 S O C 培养基重悬沉淀。分别涂到 2 0 个 Y T A G 平板（p C A N T A B 5E 质粒含氨苄青霉素抗性基因）。 25°C 孵育16h 。 26 . 每块板子挑取单个菌落到10ml Y T A G 培养基。同步骤 2 5 , 离心收集细胞。 IOml 含 1 5 % 甘油的 Y T A G 培养基重悬。 1 0 倍梯度稀释转化细胞，涂到 Y T A G 琼脂培养平板上检测文库扩增程度25°C 培养过夜。其余分装 Iml/管，一 80°C 保存。文库应® 含有 IO7〜IO8克隆。扩增后的文库应当含有101°〜IO11克隆形成单位 (C F U )A n l 0 质量评估：在检测文库容量的平板中挑取10〜2 0 个分离良好的克隆作为P C R 检测文库质量和差异的模板（见辅助方案 2)。如果是高质量的文库，每个克隆的 P C R 扩增产物都含有不同的限制酶酶切模式（R F L P )。$

$噬菌体文库的培养和复苏 3 . 第一天：接种细菌文库储存液（约 1 X 101()个克隆）到 100m l 2 X Y T A G 培养基中， 37°C 持续振摇培养直至O D 議为 0.5 (1.5〜2h )。 4. V C S -M 1 3 或者 M 13K 0 7 辅助噬菌体感染细菌，比例为1 : 20 (细菌数目：辅助噬菌体颗粒， 1〇〇 6。。= 2 \ 1 0 8个细菌/!111)。 37°〇无振摇培养30111丨11，然后转入37°〇以 250r/m i n 的速度持续振摇继续培养30m i n o 5 . 转化细菌室温， 330(^离心10111丨11， 1001111¥丁八1^培养基重悬细菌， 301：持续振摇培养过夜（250undefined/m i n)。 6 . 第二天： 4°C ， 8000g 离心 IOmin (或者 3300g ， lOmin) ，转移上清到新的离心管。加入 1/5体积的 P E G /N a C l 。混匀，冰上放置 I h 以上。 4°C ， 10 8 0 ( % 离心 30m i n ，弃上清， 40m l 双蒸水重悬沉淀。加入 8m l P E G /N a C l ，混勻，冰上放置20m i n 以上。 4°C ， 10 800g 离心 l Omin。小心吸去上清。再次瞬时离心，尽可能吸干残留液体。 7. 5m l P B S 重悬沉淀，室温， 11 600g 离心 l O min。噬菌体上清在4°C 可短期保存，在含 1 5 % 甘油的 P B S 中，一70°C 可长期保存。新鲜复苏的噬菌体用来亲和筛选。 8 . 噬菌体的冻存液用无菌P B S 10倍梯度稀释，检测滴度。梯度稀释的噬菌体（从 IO7 开始）感染 T C M (步骤2)，两者混合37eC 培养 30m i n 。感染的细胞涂到 Y T A G 平板上， 37°C 培养过夜。噬菌体冻存液的滴度应当为1〇 12〜1〇 13个细胞/m l 。生物富集：第一轮筛选 9 . 第二天： 4m l 抗原（10〜 100/xg/m l 抗原， P B S 配制，或者 50m m o l /L 碳酸氢钠 p H 9. 6 ) 包被 N u n c 抗原管， 4〇 C 过夜（图 14. 3. 3)。 10. 第三天： P B S 快速洗三次，加满 2 % M P B S 封闭。密封，室温或者37°C 孵育 2h (根据抗原的稳定性）。 P B S 洗三次。 11.加入 IO11〜IO12复苏噻菌体到4ml 2 % M P B S 。室温在旋转器上孵育1〜2h 。每次清洗都要用缓冲液完全填满管子，然后快速吸干。第一轮筛选，抗原管用P B S T 洗 10 次，然后用 P B S 洗 1 0 次去除清洁剂。第二轮及后面的筛选，抗原管用 P B S T 洗 20 次，然后用 P B S 洗 2 0 次。 12. 加入 l m l l O O m m o l /L 三乙胺，并继续在旋转器上孵育30m i n ，洗脱噬菌体。 13. I m l 噬菌体洗脱液立即加到预先准备的含〇• 5ml lmol/L P H 7. 4 Tris • C l 的管中快速中和。 14. 洗脱后，向免疫管中再加入200/x l p H 7 . 4 的 lmol/L T r i s . Cl，中和管子残余的噬菌体。旋转管子使得每部分都能接触到中和溶液。 15. 吸取步骤2 中 9. 25m l 处于对数生长期的T G -I 细菌，加入 0.75m l 的已中和的噬菌体洗脱液，同时在免疫管中也加入4m l T G ~l 细菌。 37°C 静置 30m i n 。 16. 收集 I O m l 和 4m l 噬菌体感染的T G -I 细菌。取 100M 1进行 IO4〜IO5稀释。稀释液涂于 Y T A G 平板。 37°C 培养过夜观测富集产出。 17. 剩下的丁0-1细菌室温， 330(^离心1〇 1^11。 111112\丫丁重悬细菌沉淀；分涂到 4 个 Y T A G 平板。 30°C 培养过夜或者可以见到克隆为止。$
图 14. 3, 3 固相抗原亲和层析（A) 或者是溶液中生物素化抗原富集 scFv展示噬菌体（B) 。多轮富集 18.第四天：在富集产出平板中加入5〜6m l 含 1 5 % 甘油的 2 X Y T 培养基，用接种环刮下细菌。吸取50〜100/11菌液到1001111丫丁八〇培养基， 37°〇持续振摇（25(^/11^)