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        有没有做过cell free表达蛋白的大神!

        相关实验:表达蛋白检测实验

        user-title

        菠菜茼蒿

        现在一点都表达不出来,不知道哪儿有问题,有没有经验可以分享分享呀

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        3 个回答

        user-title

        sswei

        有帮助

        无细胞技术(cell-free)蛋白质表达上的应用,作为近年来单独列出的蛋白表达系统,主要用于表达膜蛋白等难以在细胞内获取的蛋白。膜蛋白在细胞间联系、表面识别、细胞骨架接触、信号传导、酶活性及物质运输中扮演了重要角色。由于其具有多种细胞功能,膜蛋白是非常理想的药物靶标。但是,膜蛋白的其复杂的优化过程使得纯化非常困难并且耗费时间。无细胞技术可以用来来获得高得率的可溶性的膜蛋白。在无细胞技术 无细胞技术(cell-free)膜蛋白时,有时候会加入Nanodisc(纳米磷脂盘),获得稳定的蛋白质,其应用范围包括生物物理学分析、表面等离子共振、核磁共振和冷冻电镜的质谱分析。

        Nanodiscs可使膜蛋白处于一个类似磷脂双分子层的环境中,从而保证膜蛋白能够像在天然的细胞膜中维持其构象和生物学功能。Nanodisc能够很好地维持膜蛋白的稳定,从而可以在膜蛋白领域的研究工作起到很大的作用。Nanodisc是由膜支架蛋白(membrane scaffold proteins,MSPs)和磷脂分子构成的磷脂双分子层类膜结构。

        根据不同的实验情况,多数时候可以使用两种不同的方法来包裹其想要获得的膜蛋白:

        1) 对于已经分离并溶解在去污剂中的膜蛋白,我们推荐使用膜支架蛋白(MSPS)并配合磷脂分子使用。

        2) 针对无细胞表达系统所生产的膜蛋白,推荐使用空载并已经组装好的纳米磷脂盘来包裹/插入其目标膜蛋白。

        user-title

        huarenqiang5

        有帮助

        无细胞蛋白合成系统(cell-free protein synthesis system),也叫做体外(in vitro)蛋白表达系统,本系统中包含转录、翻译的全部元件,如T7 RNA聚合酶、核糖体,折叠元件等,加上核酸模板(DNA或者mRNA),无需活细胞即可以进行蛋白合成(图1)。

        图片描述

        一、无细胞蛋白合成系统优势:

        1. 特异性好:只有目标蛋白才会被合成,合成产物无需进行复杂的纯化步骤。

        2. 不含核酸酶和蛋白酶。

        3. 省时间,操作简单:

        1)无需细胞的转化,培养和诱导;

        2)适用于质粒和PCR扩增合成的线状DNA模板;

        4. 克服蛋白毒性:即使对宿主细胞有毒性的蛋白也可以顺利合成。

        5. 系统灵活性:

        1).可对合成系统进行个性化调整:自行添加chaperones,去垢剂,修饰酶等其他添加物;

        2)·可实现高通量的模板和合成条件的筛选,大大节省时间和精力。


        图片描述


        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        您可以检查以下几个可能的问题:

        DNA 模板的质量:确保 DNA 模板是完整、纯净的,没有受到污染或降解的影响。建议使用质量较高的 DNA 制备技术,如商业化 DNA 制备服务或基于硅胶柱纯化的 DNA 提取。

        反应体系的完整性:检查 cell-free 表达体系是否完整,包括底物、缓冲液、酶等。确保反应液体系中的每个组分都已正确添加,并且在合适的浓度下。

        反应条件的优化:考虑对反应条件进行优化,例如反应温度、时间、盐浓度、pH 值等。这可以通过一系列实验来确定,例如反应时间和温度的梯度测试等。

        蛋白表达的检测方法:确保您使用敏感的蛋白表达检测方法来检测您的蛋白质。例如,使用 Western blot、SDS-PAGE、质谱等方法来检测表达的蛋白质。

        移除抑制剂:如果您的反应体系中存在可能抑制蛋白质表达的物质,例如 EDTA、肝素、抗生素等,建议将其移除或调整浓度。

        切换表达体系:如果您无法在当前体系中表达蛋白质,您可以尝试使用其他的 cell-free 表达体系,例如 E. coli、小鼠乳腺癌细胞系等。

        这些都是可能导致 cell-free 表达失败的一些常见问题和可能的解决方法,希望能对您有所帮助。

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