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        点印迹法

        相关实验:表达蛋白检测实验

        最新修订时间:

        原理

        本方案用DNA点迹杂交检测噬斑以鉴定重组病毒。像点迹杂交一样,将感染细胞裂解物印迹在硝酸纤维素膜上(可参考「痘苗DNA检测实验」中「斑点杂交法」)。用可以识别外源基因表达蛋白的抗体与膜一起孵育,用125I 标记的蛋白 A 检测结合的抗体,还可应用化学发光检测系统,如 Amersham ECL。随后膜在 X 射线胶片下曝光。

        材料与仪器

        步骤


        1. 病毒感染细胞并完成筛选(见「痘苗DNA检测实验」中「PCR 法」步骤 1~9)。


        2. 轻轻刮下细胞,转移到离心管中,最大转速离心 30 s,弃培养基,用 200 μl PBS 重悬。24 孔培养板中的细胞也可用 1 ml 的注射器的活塞刮取。


        3. 冻融并超声细胞悬液(见「痘苗DNA检测实验」中「PCR 法」步骤 11、12)。


        4. 将硝酸纤维素膜剪至适合点迹仪大小,将其用水浸湿,放入仪器中,每孔中加入 20~100 μl 的细胞悬液(步骤 3),用抽吸的方法使液体流过硝酸纤维素膜,随后将膜取出。


        5. 用含 4% BSA 的 PBS/Tween 浸润硝酸纤维素膜 30 min,用不含 BSA 的 PBS/ Tween 洗 1 次。


        6. 将外源蛋白抗体用最小体积的 PBS/Tween 以 1:50~1:5000 稀释,与膜室温孵育 ≥ 1 h。


        7. 用大体积 PBS/Tween 清洗膜 5 次。


        8. 用含有 1 μCi/ml [ 125I ] 标记的蛋白 A 的最小体积 PBS/Tween 与硝酸纤维素膜孵育 30 min。此外,化学发光检测系统(如 Amersham ECL)也可检测抗体。


        9. 用大体积 PBS/Tween 清洗膜 5 次。


        10. 用塑料薄膜将硝酸纤维素膜包好,X 射线胶片放射自显影。

        注意事项

        1. 所有培养都在加湿的 37℃ 5% CO2 培养箱中培养,除非有特殊说明。


        2. 与活细胞接触的器械和试剂都应该是无菌的,操作也必须无菌。


        3. 除用重组蛋白抗体替换抗痘苗病毒抗体之外,可用「鸡胚成纤维细胞制备实验」、「MVA病毒储液制备实验」介绍的免疫染色法对含有噬斑的感染细胞进行原位染色。

        来源:丁香实验

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