实验问答22,819,521 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问ELISA操作咨询各位前辈

sswei

ELISA中加样须注意如下问题：　　1.吸取样品时，加样枪吸头不应黏附多余的液体;加样时不可90度向孔中滴加液体，这样会导致液体残留在吸头上，加样不准确!　　2.不要将吸头伸入孔中，一方面若接触孔底可能压弯吸头，另一方面可能会将孔中的液体吹起来，加样不准确!　正确的加样方法应为45度，吸头贴着孔壁加入，应注意：　　1.角度太小，会使液体残留在孔壁上，导致加样不准确!　　2.吸头应当贴着管壁和液面的

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问蛋白质免疫印迹实验为什么要蛋白质还原和变性

loveliufudan

蛋白质免疫印迹实验中的蛋白质样本还原和变性是为了使其线性化并暴露出可被抗体识别的特定蛋白结构，这样可以提高抗体的特异性和亲和力。还原是指还原性试剂（如二巯基乙醇）将蛋白质中的二硫键还原成单个硫原子，使其变为线性状态。这对于有多个二硫键的蛋白质尤为重要，因为二硫键交联的结构会使蛋白质失去线性性和空间构象，从而影响抗体的结合效率和特异性。变性是指蛋白质在高温或有机溶剂等条件下发生的结构变化，使其失去原

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问WB实验中总是在目标条带下面还有点细细的小条带，不知道如何去除？留着很丑。此外，目标条带，分析软件哪个更好？

sswei

可以采用以下方法去除小条带:1、更换一抗，换单克隆的。2、不换一抗，降低一抗稀释比，这样目的条带会变弱，不过杂带也会，有时候就可以去掉杂带了。3、多封闭一下。4、洗膜的时候多洗几次。

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问co-ip一般都选用哪种裂解液？课题组有RIPA（强），还有自己配的强、中、弱的裂解液，应该选哪种比较合适？

土井挞克树

一般首次使用应该选择中度的裂解液，避免过度裂解和裂解不充分

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问western blot同一批sample出来的条带趋势完全相反，为什么会这样？

huarenqiang5

考虑是转膜时没贴紧导致电流分配不均或显色过程中显色液加得不均匀造成的。

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问southern blot搭桥容易倒，用什么装置比较好？

土井挞克树

可以用木架或者木板代替三折纸，会稳固很多

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问制备western blot分离胶后，使用无水乙醇还是纯水进行液封？两者有何不同吗？

土井挞克树

建议使用无水乙醇液封，无水乙醇对分离胶影响小

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问WB实验使用的膜哪种最好啊？

huarenqiang5

Pvdf膜跟nc膜有的区别及选择：一、硝酸纤维素NC膜的优点1.使用方便，操作简单，兼容多种检测方法，与 PVDF 膜相比，不需要甲醇浸泡过程，这样使得那些需要亲水环境下的蛋白质转移。在转移前，仅需要在水中简单润湿，然后置于转移缓冲液中，不需要其他的预湿步骤了。2. 背景低：除了具有高结合力外，硝酸纤维素膜本身产生的背景非常低，膜特有的表面性质保证了优异的信噪比，在膜洗脱时不需要严格的洗脱条

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问wb抗体和elisa抗体有什么不同要求？

sswei

一般来说用于 western 的抗体主要识别氨基酸序列特异性；而可用于 ELISA 的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。

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问免疫沉淀实验中，如何判断抗体的亲和性和特异性，是否有其他实验可以用于确认结果？

sswei

抗体特异性验证的几种方法:1. 多抗体验证，2.基因敲除/敲降验证，3.天然差异对照验证，4.酶法检测验证

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问ELISA实验中，怎样选择最佳的包被抗原浓度以获得最高的灵敏度和特异性？

龙大人驾到

1. 初始的抗原包被浓度可以根据文献或前人经验进行初步选择。2. 进行一系列抗原包被浓度的实验，产生一组数据，以评估不同浓度下的ELISA信号，并确定最佳浓度。3. 可以通过稀释抗原溶液来获得不同的抗原包被浓度。例如，对于包含1mg/ml抗原的溶液，可以通过将其与缓冲液按比例混合并逐步稀释到0.1mg/ml、0.01mg/ml等浓度。4. 对于每种稀释物，与一定数量的特异性抗体进行结合。结合后，可

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问Elisa结果不是特别好，老板让做elispot.有详细的步骤么有大佬做过么，要注意什么

huarenqiang5

直接间接法刺激方法：建议用PMA和娄诺霉素刺激PBMC，使其产生IFNγ。在培养液中稀释PBMC，其中含1ng/ml PMA和500ng/ml娄诺霉素（Sigma, Saint Louis, MO）。加5X104至3x105个细胞到抗体包被的PVDF孔，孵育箱中孵育10-15小时。其它的刺激剂孵育时间可能不同，基于细胞因子生成细胞的量，按不同情况作最佳选择。操作过程1. 用50ul 70%酒精孵育

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问原核表达IPTG诱导问题求助

sswei

反应条件较复杂，特别是对自己设计的引物来说，选择合适的退火温度，是需要慢慢摸索的，一般根据计算的退火温度降低5~10℃来进行首次扩增，如果出现了目的条带，且有杂带时，在逐步提高退火温度，以提高反应的特异性。此外，还有反应体系，电泳条件，时间等等因素。

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问请问各位大神nrf2 蛋白wb怎么跑？

豆豆是个豆

我是用12%的胶跑的，转膜、封闭、孵二抗都是两个小时，然后洗的时候不要洗那么多次，三次，每次5min就够了，不然会洗掉。nrf2本身蛋白量67，但是做WB通常是检测100KD的条带（此时nrf2可能有和其他蛋白结合），而且同一泳道nrf2通常会分裂好几条条带。

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问求助大家：PBMC可以诱导分化pDc吗，该如何做呢，请各位大神指教

龙大人驾到

PBMC可以诱导分化成pDC。以下是一种常用的方法：1. PBMC提取：从新鲜采集的人类全血中提取PBMC，方法包括梯度离心、红细胞淋巴细胞分离液等。2. 培养PBMC：将PBMC在含有GM-CSF和IL-4的培养基中培养5天以获得生长迅速的DC。3. 刺激分化：将培养的DC在缺乏血清的培养基中刺激24小时，通常使用CpG DNA进行刺激，也可使用病毒、细菌等免疫刺激物。4. 分化pDC：将刺激过

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问snail泛素化

dxy_xextz7w2

检测泛素化不是检测特定的条带，泛素化的范围广因此要检测整个蛋白泳道的

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问Elisa洗板子的时候如果没有PBST可以用PBS代替么，吐温的作用是什么

土井挞克树

可以用pbs多冲洗几次，吐温主要是表面活性剂

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问LPS诱导细胞炎症促进防御素表达

汤姆卜丽波

可以分析你的测序结果啊，看看不同浓度诱导的表达有什么差异

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问为什么跑蛋白，STAT3含量基本不变？

龙大人驾到

这是因为STAT3与p-STAT3的含义不同。STAT3是一种蛋白质，其含量在治疗前后基本不变。而p-STAT3是一种磷酸化修饰形式的STAT3，其含量会随着外界信号刺激而发生变化。当外界信号刺激到细胞时，激活的激酶会磷酸化STAT3，将其转化为p-STAT3，p-STAT3进入细胞核后调控相关基因的转录。因此，检测STAT3和p-STAT3可以了解到外界信号刺激是否引起了STAT3的磷酸化修饰。

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问这个是什么原因啊？是转膜温度太高了吗？但是并不是特别热啊只是稍微热一点点🤏

秋秋欣欣

也可能是蛋白的问题，有点弥散。

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