实验问答21,906,797 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问SDS-PAGE电泳实验相关问题？

府宅

1.缓冲溶液、SDS都要新鲜配制。2.避免加样过多，提高分辨率。小体积样品可给出窄带，加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15uL（即2-10ug蛋白质）。3.加热变性后的蛋白质样品要放置到室温即电泳，不要久放，因为蛋白质的二硫键在高温下可能是会断开，但是暴露于空气中温度降低会重新形成二硫键，而且可能在过久放置过程中蛋白质可能会再折叠，更不要扔到冰箱里保存。

4 回答898 围观

问请问跑wb的一抗和二抗最多能重复用几次呢？如果配好了暂时先不用，放在-40℃冰箱能保存多久？

whilt-shirt

重复用的次数要视情况而定，常规的用10来次不成问题，配好的抗体一般在4℃条件下能保存2-3个月

3 回答6238 围观

问纯化好的蛋白怎么才能保持时间久一点？

府宅

短期保存（1周内）：对于短期保存，大多数蛋白可以保存在4 摄氏度下。4摄氏度下保存面临最大的问题是微生物的污染。因此，如果保存时间超过24小时，建议利用0.22 um的滤膜过滤样品，除菌后保存在无菌的管子中。值得注意的是，并不是所有的蛋白质都适合保存在4度下。长期保存：对于长期保存，冷冻是必须的。蛋白质溶液在速冻后可以在-20度或-80度中进行，-80度下的蛋白可以保存更长久。长期保存蛋白质的另一

2 回答2887 围观

问细胞提蛋白，有时候会出现胶状物，说明书说是正常现象，可以加点sds，但是加完依旧是胶状的，是什么原因？

whilt-shirt

换专用的提取试剂盒试试吧，这有可能是细胞数太多导致的

3 回答4272 围观

问跑出来的杂带太多了，还有脱尾存在，杂质怎么去除？这么多去杂质的溶剂，放的先后顺序是什么？

whilt-shirt

要先确定实验过程中的所有操作步骤都是正确的，这样才能找到问题所在，杂带有可能是抗体浓度太高或者敷育时间过长都会导致杂带，或者更换封闭液可能会减少杂带

2 回答402 围观

问加了PMSF，为什么曝光出来条带和内参效果一样呢？

whilt-shirt

PMSF是蛋白酶抑制剂，是防止蛋白降解的，对内参和目的蛋白不会有影响。目的蛋白和内参效果一样可能是一开始实验就出了问题

1 回答329 围观

问原核表达蛋白纯化问题

丁香粉猪猪

一些蛋白质或 DNA 与带有标签的目的蛋白发生了非特异性相互作用，可以用低浓度的去污剂（2%的 TritonX-100 或浓度不大于 0.5%SDS)洗涤样品（上样洗脱时）或增加洗脱液的盐浓度（氯化钠溶液低于 2mol/L）。柱子没平衡好，平衡缓冲液没加咪唑，平衡液 PH 不适合，缓冲液 pH 要与蛋白质 pI +/-1-2

3 回答799 围观

问用脱氧胆酸去干扰是直接加进去吗？浓度是多少呢？

dxy_gwrp7ndq

直接加入，脱氧胆酸的纯度为至少96%

1 回答359 围观

问加入考马斯蓝试剂后需要在多长时间内测完？样品太多，放置时长太长会不会有影响？

Kimser

2分钟内就可以和蛋白质结合，能稳定存在1h。放置时间没有确切时间，不过要4℃保存，再用记得复温

2 回答667 围观

问要测的蛋白的标准分子量在哪个网站上或书里查找呢？

菲菲飞呀飞

NCBI上可以查分子量，还有其它的方也可以查。我推荐几个吧：Genecards: www.genecards.orggentlas:genatlas.medecine.univ-paris5.frUniprot:http://www.uniprot.org

3 回答1367 围观

问IPTG诱导蛋白蛋白表达不出来

府宅

建议可以尝试改用酵母或者昆虫细胞表达。甚至直接用哺乳细胞表达。如果一定要用BL21表达，我的建议是尝试用较低浓度IPTG在较低温度比如室温下表达更长时间，温和的表达条件运气好的话能稍微让蛋白质没那么容易misfold，不过不要抱太大希望。如果还是表达不出来，截短蛋白到70kDa左右。专注于一部分蛋白

2 回答3350 围观

问WB条带不均一，颜色一半深一半浅是怎么回事？

whilt-shirt

有可能是发光液没加好，也有可能是转膜时问题，还有可能是抗体敷育时条带未完全浸泡在抗体稀释液里面

3 回答4453 围观

问哪种方法能够很好的进行蛋白印迹分析

whilt-shirt

常规用的是Western Blot，条带图用Image J 进行灰度分析

1 回答332 围观

问蛋白质纯化实验相关问题

菲菲飞呀飞

1、在进行一个蛋白纯化之前，应该对其蛋白有所研究，包括其性质，敏感性，例如该蛋白的溶解性，对高盐或pH敏感，是否容易氧化等； 2、需要考虑蛋白质的用途，来决定制备蛋白的量级规模，这就要考虑到层析柱的尺寸，得到的蛋白浓度如何，是否需要保持其活性以及避免不必要的污染物；

3 回答599 围观

问实验数据的收集和分析有没有好的软件推荐？

菲菲飞呀飞

1、Excel 为Excel微软办公套装软件的一个重要的组成部分，它可以进行各种数据的处理、统计分析和辅助决策操作，广泛地应用于管理、统计财经、金融等众多领域。 2、SAS SAS由美国NORTH CAROLINA州立大学1966年开发的统计分析软件。SAS把数据存取、管理、分析和展现有机地融为一体。SAS提供了从基本统计数的计算到各种试验设计的方差分析，相关回归分析以及多变数分析的多种统计分析过

3 回答581 围观

问蛋白质样本提纯总是不达标，怎么提高提纯纯度？

dxy_gwrp7ndq

1、延长裂解时间，并且反复吹打，10min吹打一次。2、改变方法：用细胞刮刀将细胞刮下，离心收集细胞，在离心管里裂解细胞（如有超声，可以加超声）

2 回答497 围观

问蛋白质测序结果多次失败，怎么提高实验的成功率？

whilt-shirt

在目前条件下，质谱很难100%给出肽段的序列，经常会丢失一些肽段，蛋白质磷酸化修饰也会抑制胰蛋白酶的酶解，并且磷酸化肽的含量较非磷酸化肽段的含量少很多，质谱对质谱分析仪磷酸化肽的响应就可能会被抑制。因此，要尽可能把非磷酸化肽段的含量降到。减少非磷酸化肽的方法有分馏、IMAC（固相化金属亲和色谱）和抗体结合。通过MALDI-TOF-MS测定肽段的分子量，根据所得肽段分子量比预计的分子量大80Da或其

1 回答572 围观

问预防蛋白质样本变性方面有什么需要注意的地方？

whilt-shirt

环境可以影响蛋白质，如温度、重力等因素都会使蛋白质变性，保持低温和适当的酸碱度，给其温和环境

3 回答570 围观

问蛋白质定量实验的注意事项有哪些？

Kimser

说一个才被老师说的事情，因为封闭时有点事情导致封闭时间过久，结果我的蛋白没有显色，，，本来以为问题不大，结果也不说啥都没有，但基本算是白做了。此外，一抗或者二抗的时间也需要安排好，最好是弄个定时器放旁边

4 回答746 围观

问配胶的时候一直不凝怎么回事

whilt-shirt

有可能是配胶试剂没混匀导致，也有可能是配方问题

3 回答346 围观

关于丁香通

公司信息

个人用户

企业机构

无忧采购轻松科研

提问

扫一扫

实验小助手

扫码领资料

反馈

TOP

打开小程序