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问
跑出来的杂带太多了,还有脱尾存在,杂质怎么去除?这么多去杂质的溶剂,放的先后顺序是什么?
whilt-shirt
要先确定实验过程中的所有操作步骤都是正确的,这样才能找到问题所在,杂带有可能是抗体浓度太高或者敷育时间过长都会导致杂带,或者更换封闭液可能会减少杂带
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问
加了PMSF,为什么曝光出来条带和内参效果一样呢?
whilt-shirt
PMSF是蛋白酶抑制剂,是防止蛋白降解的,对内参和目的蛋白不会有影响。目的蛋白和内参效果一样可能是一开始实验就出了问题
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问
原核表达蛋白纯化问题
丁香粉猪猪
一些蛋白质或 DNA 与带有标签的目的蛋白发生了非特异性相互作用, 可以用低浓度的去污剂 (2%的 TritonX-100 或浓度不大于 0.5%SDS)洗涤样品 (上样洗脱时) 或增加洗脱液的盐浓度 (氯化钠溶液低于 2mol/L) 。柱子没平衡好,平衡缓冲液没加咪唑,平衡液 PH 不适合,缓冲液 pH 要与蛋白质 pI +/-1-2
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问
用脱氧胆酸去干扰是直接加进去吗?浓度是多少呢?
dxy_gwrp7ndq
直接加入,脱氧胆酸的纯度为至少96%
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问
加入考马斯蓝试剂后需要在多长时间内测完?样品太多,放置时长太长会不会有影响?
Kimser
2分钟内就可以和蛋白质结合,能稳定存在1h。放置时间没有确切时间,不过要4℃保存,再用记得复温
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问
要测的蛋白的标准分子量在哪个网站上或书里查找呢?
菲菲飞呀飞
NCBI上可以查分子量,还有其它的方也可以查。我推荐几个吧:Genecards: www.genecards.orggentlas:genatlas.medecine.univ-paris5.frUniprot:http://www.uniprot.org
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问
IPTG诱导蛋白蛋白表达不出来
府宅
建议可以尝试改用酵母或者昆虫细胞表达。甚至直接用哺乳细胞表达。如果一定要用BL21表达,我的建议是尝试用较低浓度IPTG在较低温度比如室温下表达更长时间,温和的表达条件运气好的话能稍微让蛋白质没那么容易misfold,不过不要抱太大希望。如果还是表达不出来,截短蛋白到70kDa左右。专注于一部分蛋白
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问
WB条带不均一,颜色一半深一半浅是怎么回事?
whilt-shirt
有可能是发光液没加好,也有可能是转膜时问题,还有可能是抗体敷育时条带未完全浸泡在抗体稀释液里面
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问
哪种方法能够很好的进行蛋白印迹分析
whilt-shirt
常规用的是Western Blot,条带图用Image J 进行灰度分析
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问
蛋白质纯化实验相关问题
菲菲飞呀飞
1、在进行一个蛋白纯化之前,应该对其蛋白有所研究,包括其性质,敏感性,例如该蛋白的溶解性,对高盐或pH敏感,是否容易氧化等; 2、需要考虑蛋白质的用途,来决定制备蛋白的量级规模,这就要考虑到层析柱的尺寸,得到的蛋白浓度如何,是否需要保持其活性以及避免不必要的污染物;
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问
实验数据的收集和分析有没有好的软件推荐?
菲菲飞呀飞
1、Excel 为Excel微软办公套装软件的一个重要的组成部分,它可以进行各种数据的处理、统计分析和辅助决策操作,广泛地应用于管理、统计财经、金融等众多领域。 2、SAS SAS由美国NORTH CAROLINA州立大学1966年开发的统计分析软件。SAS把数据存取、管理、分析和展现有机地融为一体。SAS提供了从基本统计数的计算到各种试验设计的方差分析,相关回归分析以及多变数分析的多种统计分析过
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问
蛋白质样本提纯总是不达标,怎么提高提纯纯度?
dxy_gwrp7ndq
1、延长裂解时间,并且反复吹打,10min吹打一次。2、改变方法:用细胞刮刀将细胞刮下,离心收集细胞,在离心管里裂解细胞(如有超声,可以加超声)
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问
蛋白质测序结果多次失败,怎么提高实验的成功率?
whilt-shirt
在目前条件下,质谱很难100%给出肽段的序列,经常会丢失一些肽段,蛋白质磷酸化修饰也会抑制胰蛋白酶的酶解,并且磷酸化肽的含量较非磷酸化肽段的含量少很多,质谱对质谱分析仪磷酸化肽的响应就可能会被抑制。因此,要尽可能把非磷酸化肽段的含量降到。减少非磷酸化肽的方法有分馏、IMAC(固相化金属亲和色谱)和抗体结合。通过MALDI-TOF-MS测定肽段的分子量,根据所得肽段分子量比预计的分子量大80Da或其
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问
预防蛋白质样本变性方面有什么需要注意的地方?
whilt-shirt
环境可以影响蛋白质,如温度、重力等因素都会使蛋白质变性,保持低温和适当的酸碱度,给其温和环境
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问
蛋白质定量实验的注意事项有哪些?
Kimser
说一个才被老师说的事情,因为封闭时有点事情导致封闭时间过久,结果我的蛋白没有显色,,,本来以为问题不大,结果也不说啥都没有,但基本算是白做了。此外,一抗或者二抗的时间也需要安排好,最好是弄个定时器放旁边
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问
配胶的时候一直不凝怎么回事
whilt-shirt
有可能是配胶试剂没混匀导致,也有可能是配方问题
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问
蛋白质印迹细胞提取液问题?
dxy_gwrp7ndq
也不排除你的抗原浓度过高,这时再加入适量上样缓冲液即可。
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问
SLE中Sm抗体为何检测率这么低?
dxy_gwrp7ndq
抗 Sm 抗体在 SLE 中特异性高,但敏感性低
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问
大家都怎么防止蛋白降解啊?
whilt-shirt
1、在样品制备过程中添加蛋白酶抑制剂;2、样本用液氮保存,超低温下蛋白降解慢。
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问
ACTIN为啥有两个条带?
DXY泡沫呀
有实验技术的原因,曝光的时候会有底片轻微移动的现象,出现很接近的两条
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