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科研学霸天团，48小时有问必答

问跑western blot的时候同一个抗体同一个细胞系或者组织，出现条带数不一致的原因

dxywode

条带位置异常可能是蛋白出现聚体或被修饰，蛋白出现降解有关。

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问如何选择凝胶，以及层析柱？

bqejjh123

层析柱的选择一般根据分离样品的种类而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的 25～100 倍；而除盐或除游离荧光素时，柱床体积约为样品体积的 4～10 倍。层析柱太短会影响分离效果，如太长会延长分离时间和过度稀释样品。层析柱的内径过细会发生「器壁效应」。层析柱的内径和高度有一定的比例，除盐柱应为 1:5～1:25，纯化蛋白质柱应为 1:20～1:100。

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问骨组织wb内参不齐怎么整？

dxy_gwrp7ndq

不齐可以进行定量分析，然后用目的蛋白除以内参。定量用image plus6

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问wb怎么根据内参调整上样量

whilt-shirt

先用Image J计算内参的灰度值，然后选择其中一个样本作为参照，用这个参照样本的灰度值除以其他各组样本的灰度值再乘以各组上样量，就得到最终各自的上样量

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问样品体积增加后，对蛋白质的纯化效率有怎样的影响？

迟C迟

样品体积增加，是提取的样品量增加了吗？建议裂解液同步增加，裂解时间也需要延长，不然会影响蛋白纯化效率。

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问免疫组化时染色比较弱拍图不好看怎么调整？

dxywode

小心处理组织样本，尽量保持组织细胞结构的完整性。如果组织的穿透力差，则要制备较薄的切片。调整好固定液的理想pH、固定时间和温度。可考虑用单抗（不是多抗），避免交叉反应。如果非特异性结合太强，则适当减少抗体的孵育时间。

3 回答1068 围观

问做WB曝光后目的蛋白位置出现2个相邻条带，但是抗体说明书上没有提过会有2条带情况，原因可能是什么呢？

邓豆豆逗

可以先看一下抗体官网的一些效果图，是否做出来有两条带的现象，其次查一下相关文献，看这个蛋白是否有剪切体或一些修饰之类的，还有可能是蛋白降解了，这时候可以找一个阳性对照一起做，如果阳性对照是单条带，就考虑是样本的原因了

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问怎样提高WB实验蛋白定量与上样量的效率及准确性？

bamboopiggy

这个，只能说勤能补拙，多做，经验丰富了就好了。一般情况下，在做标曲的时候，加样要准确，标曲出来的R^2值，接近0.99最好。样品稀释时，枪尖要和枪match，吸液时，枪尖别下的太深。上样时，同样注意枪尖和枪的match程度，以及枪的准确性。

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问蛋白质的等电点是否与蛋白质的质量有关？

天一湖医者

蛋白质是两性电解质，其等电点和它所含的酸性氨基酸和碱性氨基酸的数量比例有关。各种蛋白质因氨基酸残基组成不同，等电点也不一样。

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问蛋白纯化常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象，怎么解决？

桐轩456

首先我们要知道包涵体形成是因为外源性重组蛋白在高表达时，由于蛋白折叠辅助因子不足，在蛋白折叠之前分子间连接的疏水表面暴露在外面，导致折叠中间体大量堆积，并且这些中间体对蛋白酶的降解有抑制作用；对于大量折叠错误蛋白的出现，重组细菌体内缺乏相应的反应机制来恢复蛋白的正确折叠；促进细胞表达的蛋白多肽的溶解和正确折叠功能的丧失；蛋白或多肽自身结构在热力学和动力学上失衡；一些环境因素(如高温、酸性介质)能明

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问蛋白诱导时间如何确定？IPTG大家都用什么浓度？

会心UY7N

我们一般用 0.5mg/ml IPTG.第一次没有做过的时候我是每隔 2h 超净台吸入 1ml 菌液，离心，加 loading 开水煮沸保存，2.4.8.10.12.16.18 的时间点，然后最后一次的全部离心，菌体保存在-80。然后将前面取得一起用 SDS-PAGE 进行凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，自己的蛋白大概多大，根据 marker 看那个大小的地方有没有很粗的带，看哪个时间开始表达的最好，就

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问怎样提高蛋白质在醋酸中的稳定性？

天一湖医者

1、尽量在相对密封和无菌的环境下快速进行分离操作2、在生理温度和压力范围内完成分离纯化操3、慎用溶剂和酸、碱、盐类，使用前要进行详细的试验，确定最佳添加量和条件;4、钝化或抑制蛋白质分解酶类的活性;5、选择合适分离方法。如:凝胶过滤、离子交换、吸附层析、亲和层析、电泳、结晶等。

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问内参蛋白有什么区别，如何选择合适的

府宅

1. 胞浆蛋白的内参与胞核蛋白的内参是不一样的；2. 在一定的实验条件下，内参蛋白的表达发生明显的变化时需要选择其他表达不变或者变化很小的蛋白；3. 当研究的蛋白的分子量与内参接近时，需要选择分子量与目的蛋白的分子量差距比较大的蛋白。

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问关于WB实验显色问题？

dxy_gwrp7ndq

做ECL的一抗浓度比DAB染色稀释10倍或20倍，适当缩短曝光时间，曝光前将膜上多余的ECL液空掉。

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问磷酸化的抗体为什么总是杂不好

bamboopiggy

我牛奶和bsa都用过，这个其实是要看你的抗体好不好用，如果抗体好用，怎么杂怎么出。如果抗体不好用，一般都杂不好。此外，可以考虑在收样的lysis里面加点磷酸酶抑制剂。实在杂的难看，就换家公司买抗体，磷酸化的抗体，一般cst的还是不错的。

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问免疫共沉淀实验的注意事项，外源IP为何只能正抓或反抓成功

府宅

1.抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。2.溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原

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问请问梯度胶好用吗？可以同时收集到20kDa和150kDa分子量的蛋白吗？

dxy_gwrp7ndq

使用梯度胶，小分子量蛋白运动至在胶浓度更高的底部（正极），同时大分子量蛋白在顶部有更好的分离。如下图：选择最佳的丙烯酰胺凝胶浓度达到高效的蛋白分离

4 回答517 围观

问蛋白印迹实验和流式细胞术都是使用抗体来检测细胞内靶标物质，两者如何选择

whilt-shirt

根据需要吧，但是最好两者都做，这样结果更可靠

3 回答420 围观

问蛋白提取研磨和破碎法选择

dxy_gwrp7ndq

研磨的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离，破碎细胞的程度比组织捣碎机高。超声处理的频率一般选在10KC至200KC，功率200-500瓦范围，处理时间有数分钟至数十分钟不等，处理过程中注意冷却。此法多用于微生物材料。

3 回答1018 围观

问DTT特性在蛋白纯化和保存中有什么作用？

bamboopiggy

Cys存在于多种蛋白中，且其中的-SH常作为活性中心发挥作用，或者，两个-SH连接成二硫键，是维持蛋白质高级构象重要桥梁。-SH具有很强的还原性，溶液被溶液中的溶解氧或其它氧化物氧化，从使蛋白失去活性。所以，在蛋白纯化和保存时，在溶液中加入一定量的DTT，以免蛋白-SH被氧化而失活

3 回答2454 围观

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