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科研学霸天团，48小时有问必答

问Co-IP下游还可以开展哪些分析实验？

迟C迟

根据你的实验目的来，多看看文献，看看相同领域的研究者是怎么做的。CO-IP一般是验证性的，下一步可以通过基因编辑在实验对象上验证蛋白功能。

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问Co-IP实验成功的评判标准是什么？

府宅

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。假如细胞内存在XY蛋白复合物，用X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也被沉淀下来。沉淀经多次洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸后离心收集上清，对上清进行免疫印迹（Westernblot，WB）检测Y蛋白的存在，如果Y出现，则说明蛋白X与蛋白Y存在相互作用，CO-IP实验成功。

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问Co-IP需要准备多少样本量？

天一湖医者

1. 细胞＞1×107；组织＞100mg；细菌湿重＞1mg；植物＞100mg；血清＞50ul2. 样品蛋白浓度＞1mg/ml，蛋白量＞200ug/样品

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问选了β-tubulin做内参，老是有非特异条带，还整整齐齐的，有什么办法解决呢？

whilt-shirt

一般这种情况要不更换新的抗体，要不降低抗体浓度

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问蛋白不表达或表达量很低，怎样快速选择最合适的表达载体？

天一湖医者

根据你的实验目的确定你所需要的表达量，是采用一个含有强启动子的载体来过量表达蛋白，还是只需要一个普通的启动子即可。根据上述原则初选出一些载体，然后找到这些载体的使用说明书（直接在网上找），里面有非常详细的说明，包括启动子信息、多克隆位点信息、载体使用范围、表达条件等。

4 回答538 围观

问我要标泛素化和非泛素化的FANCD2，用5%的脱脂牛奶封闭标不出来，2X或者3XBSA可以标出非泛素化的，但是很脏，怎么改进条件

dxy_t7p3th22

封闭可以用5%的BSA，加大上样量和抗体浓度

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问酵母RNA提取实验的水解为什么用酸进行水解而不是用碱水解？

未来9

其实是碱水解，碱性水浴条件下RNA水解为寡聚核苷酸而DNA不水解，调pH为了沉淀DNA，调pH为酸性环境可以沉淀原有的和碱性条件下水解少量蛋白质产生的氨基酸

4 回答1234 围观

问bca定量总蛋白一致内参tubulin不一致

邓豆豆逗

更换内参再试试，如果差异还是很大，说明定量结果不准，只能根据条带亮度进行上样量的调整了。（bca定量结果只能作为参考，不能作为你内参一致的依据）

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问wb中配置Running buffer和wet buffer时怎么选择SDS的浓度？

毛桃子啊

1.电泳缓冲液（Tris-Glycine/SDS）25mM Tris base190mM 甘氨酸0.1% SDS测定 pH 值并将 pH 值调整至 8.32.转膜缓冲液（湿转）25mM Tris base 190mM 甘氨酸20% 甲醇测定 pH 值并将 pH 值调整至 8.3对于大于 80 kDa 的蛋白，建议 SDS 终浓度为 0.1%。3.转膜缓冲液（半干转）48mM Tris base39

3 回答1091 围观

问western blot实验条带颜色整体都很深，是什么原因造成的？做完了还能再改进么？

邓豆豆逗

可能原因有很多，你可以逐个排查:1.封闭时间不够或封闭液不行，建议用5%脱脂奶粉封闭，封闭时间至少1h；2.洗液被污染或一抗和二抗洗涤不充分，建议更换新鲜洗液，同时延长洗涤时间和次数，比如增加到5次，每次5mim；3.ecl发光液是超敏ecl，可以用tbst稀释一下或者用普通ecl曝光；4.pvdf膜被污染，操作过程中一定不能用手碰到膜，很容易粘上脏东西被污染；5.如果是组织提取蛋白做实验的话，可

7 回答2434 围观

问影响盐析的因素具体有哪些？

迟C迟

影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。

3 回答4706 围观

问求问wb稀释一抗，一般用什么稀释好呢

dxy_a3w222q8

哈哈哈可能我比较穷，我都是用5%的脱脂奶粉做稀释液（5g奶粉+100ml 1X的TBST漂洗液，摇匀，4℃保存，现配现用）来稀释一抗的，用什么封闭就用什么稀释。

12 回答23055 围观

问Co-IP实验中使用的对照抗体有哪些？

天一湖医者

鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。

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问凝胶过滤层析过程中发现分辨率不高，可能原因是？

dxyv9281

加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。

3 回答625 围观

问凝胶柱层析关键的一环，如何选择凝胶填料？

dxywode

使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广阔的介质如Superose、Sephacryl HR依据分子量将样品分成不同组份。用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一步即可得到高纯度样品。体积大的样品，往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的

3 回答563 围观

问Co-IP实验如何避免出现假阳性？

未来9

Co-IP选择抗体尤为关键，特异性抗体可以排除非特异性结合进而排除假阳性。同时可以结合Co-IP反向验证进一步排除假阳性。若抗体浓度过高，则降低抗体浓度；若抗体特异性不好，则更换抗体。

2 回答431 围观

问蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，影响盐析沉淀的因素有哪些？

小布丁瑶瑶

蛋白质水化膜；蛋白质带电荷性可以影响

6 回答2276 围观

问Co-IP实验对抗体有什么要求

未来9

抗体的选择十分重要，选经过 IP 验证的抗体，可以减少假阳性概率。

3 回答803 围观

问为什么其他方式能验证出两个蛋白之间有相互作用，用Co-IP却没有验证出来？

whilt-shirt

首先确定两个蛋白到底有没有相互作用。可以结合酵母双杂交，LUC或者其他的实验结果。在其他实验验证有互作的情况下，调整COIP 条件。看来你的步骤，其中孵育的时间两个overnight，太长了如果某个蛋白不稳定你这两三天的实验蛋白就降解了，加抗体后2h，加proteinG beads再4h就可以了，不需要太久。另外完全可以适应标签抗体偶联好的商业化Flag beads or HA beads, 这样

3 回答797 围观

问如何确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的并避免污染的发生？

张张321

使用单克隆抗体有助于避免污染发生

4 回答653 围观

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