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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
请问怎么高效地提取膜蛋白?
dxywode
使用离心管柱分离技术起始材料仅需 undefined107 个细胞,即可将细胞 / 组织分离为细胞浆,细胞核,细胞器和质膜组分。 离心管柱带有特定孔径和表面性质,当细胞通过离心管柱,细胞膜被破裂分离出完整的细胞核,随后通过差速离心和密度离心分离出质膜蛋白,无需使用超高速离心。
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问
求再做WB实验时,最后跑出来两条清晰的条带,可能的原因有哪些呢?
未来9
有可能是同一个蛋白的磷酸化与为磷酸化的形式,分子量很接近!或者是甲基化等等!
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问
我的条带很浅显不出来怎么办?分子量也不小大约26kda
dxywode
转膜条件是否合适,先需要确定蛋白成功转至膜上一抗和二抗的比例,是经过尝试的么,有没有提前在ELISA上验证反应性。曝光显色试剂是否失效,尽量使用新鲜有效的。
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问
在显色设备支持的情况下,荧光显色和化学发光显色,如何选择?
迟C迟
关注这么几点就好了,灵敏度要高,稳定性要好,背景要低,成本最好越低越好,几种方法各有优缺点。现在化学发光显色试剂盒ECL灵敏度最高的能够达到飞克级别了,不仅灵敏度要高,检测范围也要广,我们前段时间试了炎熙的极敏型试剂盒,灵敏度很高,也有其他灵敏度的可以选择,例如增强型,超敏型,稳定性都很好。
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问
蛋白为什么要冻干?冻干对蛋白的影响有哪些?
bamboopiggy
冻干蛋白好保存,且不容易变性。冻干是物理干燥,不会影响蛋白功能。
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问
每次用配好的胶,跑胶电泳时,跑出的maker为什么总是歪歪扭扭的?
未来9
可能是边缘效应,两边的胶有可能没凝固好,或者是两边胶不匀而引起的,可以上样时留出两边的孔。
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问
wb跑出来杂带很多应该怎么办?
dxywode
首先考虑减少二抗浓度。再就是减少曝光时间和显影时间。然后加强封闭(增加BSA浓度或改用牛奶,时间应该没必要延长了 )。最后就是增强TBST洗脱 增加洗脱次数和洗脱时间
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问
wb跑胶出的条带为什么最上面还有条带?
dxywode
你可以尝试减少上样量,增大一抗稀释倍数。
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问
曝出来的目的条带位置不对,预测位置在34,结果只有55有条带,而且很明显,为什么?
whilt-shirt
可能是杂带,建议更换新的抗体试试
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问
去年在学校做的,好几次都没有结果,而且还很脏。
dxy_gwrp7ndq
二抗孵育的时间不宜过长,一般是室温下摇床孵育1~2小时,抗体孵育完成后要清洗干净,特别是二抗孵育完成后,否则可能导致显影结果出现高背景。
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问
WB跑电泳时候,肉眼可见蓝色的loading不在一条线上是为什么?是因为胶配的不好吗?
未来9
样品处理问题吧?有时制胶不好也可以,有时是电泳液的原因不一定会影响最终的结果吧
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问
WB实验,同一个样品,上样体积都一样,但在不同的孔上样,显影后,每个孔的灰度值却不一样。最左边的孔显影出来的灰度值总是最浅的。
邓豆豆逗
转膜效率不一致,可以更换海绵和滤纸,同时将胶和膜尽可能的放正中间;或者孵育一抗或二抗时膜的一端有翘起来或者贴在孵育盒上了,导致抗体孵育不充分,从而导致边上条带偏淡。
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问
10%的胶,恒压80V跑浓缩胶,120V跑分离胶,120V转膜2小时
sing生物狗
其实这个是胶的原因可能性大,建议充分混匀,跑的电压应该没问题的
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问
提取动物蛋白时加入5倍裂解液时,需要根据每样组织重量进行计算,还是可以用统一的量加?
晴天飞扬秀
根据重量加,组织重量和裂解液有个比例
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问
为什么wb条带的位置和kd值不一样
未来9
首先,SDS-PAGE电泳时分子量marker不能作为绝对标准,只是一个参考值。其次,有的蛋白(如组蛋白和一些易形成dimer的蛋白,还有一些比较难变性而又形成紧凑的球形结构的蛋白)在用常规方法电泳时会出现异常行为(表观分子量与实际分子量不符)。以前对于这个问题,似乎听实验室的师兄说,SDS-PAGE鉴定表达的外原蛋白,分子量和Marker有一定的出入,一般在10kD左右浮动还是可以接受的,也许就
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问
切分子量大的比如280的怎么避免歪歪扭扭,配胶注意点?
whilt-shirt
选择6%的SDS-PAGE胶跑蛋白,增加转膜时间和转膜电流
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问
实验中漏胶一般是什么引起的,怎么解决
sing生物狗
有可能是架子用的时间久了就会松,可以在上面夹一个1ml的枪头
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问
WB封闭时间最少要多久
邓豆豆逗
5%脱脂奶粉,封闭至少30min,这个是我们经常做的时间,一般没什么问题。时间不是很赶的话,建议封闭时间1h
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问
测定蛋白质含量用考马斯亮蓝法更好些还是酚试剂法更好些?为什么?
bamboopiggy
两个方法都可以,但是酚试剂步骤更简单一些。
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问
IP后WB鉴定到目的蛋白,为什么质谱未鉴定到
天一湖医者
一般复杂样本中蛋白种类非常多,质谱检测并不能将所有蛋白质全部鉴定到,有些丰度含量较低的蛋白在质谱结果中不一定能够完整体现;Elisa/WB相比与质谱来说灵敏度不同,前者具有放大效应,抗体会对目标蛋白有一个富集效应,所以只要选对抗体,感兴趣的蛋白基本都会被检测到;而质谱结果中,如果目标蛋白丰度较低,在组学中未检测到也是正常的,质谱检测的后期验证建议用PRM。
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