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问
在蛋白质纯化时,用PH2.0的酸性buffer洗脱,为什么不担心蛋白会遇酸沉淀?
豪杰6MBA
ph=pl ,打到蛋白质等电点蛋白会产生沉淀 ,ph2.0应该是过了蛋白的等电点,所以不会产生沉淀。
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问
300kd大小的蛋白分子转膜时间如何控制呢?
迟C迟
相对来说,大分子蛋白用湿转更好。如果想快一点就加大电压,正常两个小时差不多。
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问
同样的抗体同样的稀释比例,前一次可以敷出正常的条带,但是用于不同批次的相同处理的样品时敷出了反白的条带,是什么原因?如何解决?
bamboopiggy
反白条带出现,大概率是你蛋白浓度太高,出现了烧心现象,还来不及拍照,大量的辣根过氧化物酶就反应了,把发光试剂消耗掉了,从而没有光了。
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问
请问外泌体的生物标志物如何选择,如何鉴定啊?
vae1476
正好最近在做,外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族(CD63、CD81和CD9))、热休克蛋白家族((HSP60、HSP70、HSPA5、CCT2和HSP90)以及一些细胞特异性的蛋白包括A33(结肠上皮细胞来源)、MHC-II(抗原提呈细胞来源)、CD86(抗原提呈细胞来源)以及乳凝集素(不成熟的树突状细胞)。其中CD63、CD9、CD81以及TSG101、HSP70、ALIX等,是最常
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问
蛋白质样品可以反复冻融吗?
迟C迟
蛋白样品不建议久存,也不要反复冻融。 下游做WB实验,建议蛋白浓度测定后,加入loading buffer煮样,煮后根据实验需要分装成小管在-80℃,下次使用前拿出小管再次煮样即可。
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问
各位前辈,WB蛋白定量怎样缩短时间呀?我总是1个多小时,太耗时间。
天一湖医者
蛋白定量法开始之前我们有必要复习一下理论知识。蛋白定量至少有 5 种方法: BCA,Bradford,双缩脲法(Biuret 法),Folin 法(Lowry 法)和紫外分光光度计法。BCA 法的原理是在碱性条件下,氨基酸将二价铜还原为一价铜与 BCA 形成紫颜色的络合物,测定 562 nm 的 OD 值,所以如果样本里有还原剂(比如 DTT)的话就会对 BCA 的结果产生干扰。Bradford
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问
一个新蛋白,制备多克隆抗体时,抗原设计表达重组蛋白选择的氨基酸序列原则是什么?
vae1476
分析蛋白性质性质和特点,根据实际应用目的制定抗体,有以下原则:1)基本性质分析:查看蛋白质修饰情况(糖基化、羟基化、磷酸化、甲酰化等)、结构域特点、剪切加工等情况,如果蛋白质有后加工,应该尽可能选择一个完整“成熟体”区段进行分析。常用网站:(Http://www.uniprot.org)。2)分析跨膜区分析:进行跨膜分析最常用的网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/T
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问
WB条带模糊,有很大的阴影盖住条带,什么原因?
迟C迟
是出现非均一性背景吗?可能是你的膜曾经干过,在每一步操作过程中,都需要注意不让膜干。
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问
如何提高筛选出标记蛋白
小刘小刘世界一流FVJ4
这个问题信息量太少了,你如果已经标记好了,还是荧光标记,那就去看荧光,如果想得到这个纯化蛋白,那就去层析,
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问
请问有做磷酸化的蛋白,造模时间不同,做出来结果完全相反的吗?
whilt-shirt
首先得确定造模是成功的,建议重复试试
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问
如何确定WB结果中目的蛋白位置高于预测位置的原因
whilt-shirt
可以通过更换不同的marker来确定
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问
银染和WB哪个灵敏度更高?
迟C迟
银染的灵敏度高,但是有时候操作不好胶就变成大花脸了。
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问
想请问一下大家,检测磷酸化蛋白表达量变化的WB实验,除了加磷酸酶抑制剂之外,怎么操作可以让磷酸化蛋白更好跑出来呢?
Kimser
因为磷酸化是个可逆过程,所以除了磷酸酶抑制剂,还需要跟时间赛跑,新鲜和短时间流畅的操作会减少磷酸化的变化。当然,抑制剂仍然是关键所在,不过要注意对不同蛋白,磷酸酶抑制剂也不同。
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问
WB条带周围总是黑黑的一团,不知道怎么回事
未来9
可能的原因①膜封闭不够,建议延长封闭的时间;选择合适的封闭液。②一抗稀释度不适宜,太高,选择最适宜的抗体稀释度。③ 一抗孵育的温度偏高,建议4℃过夜孵育。④选择的膜容易产生高背景,一般NC膜的背景会比PVDF膜低,但是NC膜吸附力也就差了一点。⑤膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过,实验过程中要注意保持膜的湿润,使用镊子夹取膜。⑥检测时曝光时间过长,可减少曝光时间。
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问
为什么WB条带一个位置总是有两条,只敷了一种蛋白?
whilt-shirt
可能是抗体的特异性不好,也有可能是抗体浓度过高
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问
跑出来的带总是弯弯曲曲的怎么处理?
bamboopiggy
灌胶匀一些,或者低电压跑慢点,或者用软件拉直。
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问
跑出来的带总是很弯曲是哪里出了问题?
whilt-shirt
配胶没混匀,或者电泳液有问题。
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问
请问,敷抗低温过夜和常温2h,效果差别大吗?
天一湖医者
差别很大的,建议低温过夜,常温2小时有有可能会不显!
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问
请问大分子目的蛋白,本底表达低,每次跑出来都只能看见maker,目的条带都很若,有什么解决的办法嘛?
迟C迟
推荐使用Tris-Acetate 凝胶跑大分子蛋白,会呈现更高的分辨率。凝胶浓度与孔径成反比,即凝胶浓度越小,孔越大,较大分子量的蛋白质更容易通过,所以建议使用6-8%浓度的分离胶,当然也可以使用梯度凝胶。
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问
植物总蛋白提取相关,请问怎么提取植物总蛋白效率高,如何能western时不反白
bamboopiggy
你wb反白,就是因为你蛋白浓度高了,最好降低上样浓度试试。因为蛋白浓度高,辣根过氧化物酶反应剧烈,在你来不及显影之前,就把发光底物消耗光了,反而不能发光了。
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