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科研学霸天团，48小时有问必答

问请问特异性抗体常常出现不明的非目的条带是为什么呢？定量后的蛋白样为什么会出现有目的蛋白但无法敷育出内参的情况呢？

Kimser

非特异性条带可能是蛋白量较大，可以适当减少，也可能是蛋白不够新鲜，导致蛋白降解较多，可以更换新鲜蛋白。无法孵育的原因可能是孵育时间不够，考虑温度的原因可以适当延长孵育时间。

4 回答749 围观

问为什么有时候浓缩胶和分离胶之间有气泡，会影响实验结果吗？

丁香粉猪猪

先倒分离胶,然后加0.5ml水在分离胶上，等到分离胶凝了，再倒浓缩胶。这样不会起泡

7 回答812 围观

问想要筛选差异蛋白，怎么选择合适的技术呀？

丁香粉猪猪

可将经典学派的策略分为基于分布假设和基于传统非参数检验策略两类。（1）基于分布假设的统计策略基于分布假设策略的一般步骤可总结为：1）假设数据集服从某种特定的分布；2）建立统计模型、构造统计量；3）计算 p 值、确定阈值，比较得出结论。研究某蛋白质在两种状态下表达水平差异的显著性，相当于检验两组数据的均值是否存在差异。而 t 检验是统计方法中发展较成熟的、用于分析两组样本间均值差异的方法，t 检

5 回答508 围观

问wb条带曝光后两端颜色深，中间颜色浅，呈有过渡的渐变色是为什么？

丁香粉猪猪

转一个样也能中间淡两边深？如果大家都一样的问题，很可能是仪器问题

3 回答2855 围观

问提蛋白时要不要加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂？

vae1476

提蛋白，尤其是需要看磷酸化蛋白的时候，需要加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂

5 回答5769 围观

问WB的泛抗体实验中，为什么总是出现只有一条带的情况？

bamboopiggy

你说是泛素化抗体么？如果是的话，可能因为你那个泛素化的蛋白，在出条带的大小表达的最多，所以曝光浅的时候,能看到一条带,而不是多条带

4 回答1211 围观

问磷酸化蛋白一定需要诱导吗？是否有具体例子或者基线表达或诱导方法的综述？

Kimser

不说一定，很多情况下蛋白磷酸化是比较低的，需各种手段去刺激磷酸化表达。具体例子或综述很多，你去知网一查就能看到这里就不好打广告了

3 回答407 围观

问在蛋白质纯化时，用PH2.0的酸性buffer洗脱，为什么不担心蛋白会遇酸沉淀？

豪杰6MBA

ph=pl ，打到蛋白质等电点蛋白会产生沉淀，ph2.0应该是过了蛋白的等电点,所以不会产生沉淀。

4 回答880 围观

问300kd大小的蛋白分子转膜时间如何控制呢？

迟C迟

相对来说，大分子蛋白用湿转更好。如果想快一点就加大电压，正常两个小时差不多。

7 回答5744 围观

问同样的抗体同样的稀释比例，前一次可以敷出正常的条带，但是用于不同批次的相同处理的样品时敷出了反白的条带，是什么原因？如何解决？

bamboopiggy

反白条带出现，大概率是你蛋白浓度太高，出现了烧心现象，还来不及拍照,大量的辣根过氧化物酶就反应了,把发光试剂消耗掉了，从而没有光了。

3 回答251 围观

问请问外泌体的生物标志物如何选择，如何鉴定啊？

vae1476

正好最近在做，外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族（CD63、CD81和CD9)）、热休克蛋白家族（(HSP60、HSP70、HSPA5、CCT2和HSP90)以及一些细胞特异性的蛋白包括A33（结肠上皮细胞来源）、MHC-II(抗原提呈细胞来源)、CD86(抗原提呈细胞来源)以及乳凝集素（不成熟的树突状细胞）。其中CD63、CD9、CD81以及TSG101、HSP70、ALIX等，是最常

3 回答1182 围观

问蛋白质样品可以反复冻融吗？

迟C迟

蛋白样品不建议久存，也不要反复冻融。下游做WB实验，建议蛋白浓度测定后，加入loading buffer煮样，煮后根据实验需要分装成小管在-80℃，下次使用前拿出小管再次煮样即可。

6 回答4074 围观

问各位前辈，WB蛋白定量怎样缩短时间呀？我总是1个多小时，太耗时间。

天一湖医者

蛋白定量法开始之前我们有必要复习一下理论知识。蛋白定量至少有 5 种方法： BCA，Bradford，双缩脲法（Biuret 法），Folin 法（Lowry 法）和紫外分光光度计法。BCA 法的原理是在碱性条件下，氨基酸将二价铜还原为一价铜与 BCA 形成紫颜色的络合物，测定 562 nm 的 OD 值，所以如果样本里有还原剂（比如 DTT）的话就会对 BCA 的结果产生干扰。Bradford

5 回答343 围观

问一个新蛋白，制备多克隆抗体时，抗原设计表达重组蛋白选择的氨基酸序列原则是什么？

vae1476

分析蛋白性质性质和特点，根据实际应用目的制定抗体，有以下原则：1）基本性质分析:查看蛋白质修饰情况（糖基化、羟基化、磷酸化、甲酰化等）、结构域特点、剪切加工等情况，如果蛋白质有后加工，应该尽可能选择一个完整“成熟体”区段进行分析。常用网站：(Http://www.uniprot.org)。2）分析跨膜区分析：进行跨膜分析最常用的网站（http://www.cbs.dtu.dk/services/T

3 回答410 围观

问WB条带模糊，有很大的阴影盖住条带，什么原因？

迟C迟

是出现非均一性背景吗？可能是你的膜曾经干过，在每一步操作过程中，都需要注意不让膜干。

4 回答663 围观

问如何提高筛选出标记蛋白

小刘小刘世界一流FVJ4

这个问题信息量太少了，你如果已经标记好了，还是荧光标记，那就去看荧光，如果想得到这个纯化蛋白，那就去层析，

3 回答350 围观

问请问有做磷酸化的蛋白，造模时间不同，做出来结果完全相反的吗？

whilt-shirt

首先得确定造模是成功的，建议重复试试

4 回答221 围观

问如何确定WB结果中目的蛋白位置高于预测位置的原因

whilt-shirt

可以通过更换不同的marker来确定

5 回答948 围观

问银染和WB哪个灵敏度更高？

迟C迟

银染的灵敏度高，但是有时候操作不好胶就变成大花脸了。

3 回答1497 围观

问想请问一下大家，检测磷酸化蛋白表达量变化的WB实验，除了加磷酸酶抑制剂之外，怎么操作可以让磷酸化蛋白更好跑出来呢？

Kimser

因为磷酸化是个可逆过程，所以除了磷酸酶抑制剂，还需要跟时间赛跑，新鲜和短时间流畅的操作会减少磷酸化的变化。当然，抑制剂仍然是关键所在，不过要注意对不同蛋白，磷酸酶抑制剂也不同。

3 回答1131 围观

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