实验问答21,926,934 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问wb条带曝光后两端颜色深，中间颜色浅，呈有过渡的渐变色是为什么？

丁香粉猪猪

转一个样也能中间淡两边深？如果大家都一样的问题，很可能是仪器问题

3 回答2776 围观

问提蛋白时要不要加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂？

vae1476

提蛋白，尤其是需要看磷酸化蛋白的时候，需要加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂

5 回答5710 围观

问WB的泛抗体实验中，为什么总是出现只有一条带的情况？

bamboopiggy

你说是泛素化抗体么？如果是的话，可能因为你那个泛素化的蛋白，在出条带的大小表达的最多，所以曝光浅的时候,能看到一条带,而不是多条带

4 回答1182 围观

问磷酸化蛋白一定需要诱导吗？是否有具体例子或者基线表达或诱导方法的综述？

Kimser

不说一定，很多情况下蛋白磷酸化是比较低的，需各种手段去刺激磷酸化表达。具体例子或综述很多，你去知网一查就能看到这里就不好打广告了

3 回答393 围观

问在蛋白质纯化时，用PH2.0的酸性buffer洗脱，为什么不担心蛋白会遇酸沉淀？

豪杰6MBA

ph=pl ，打到蛋白质等电点蛋白会产生沉淀，ph2.0应该是过了蛋白的等电点,所以不会产生沉淀。

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问300kd大小的蛋白分子转膜时间如何控制呢？

迟C迟

相对来说，大分子蛋白用湿转更好。如果想快一点就加大电压，正常两个小时差不多。

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问同样的抗体同样的稀释比例，前一次可以敷出正常的条带，但是用于不同批次的相同处理的样品时敷出了反白的条带，是什么原因？如何解决？

bamboopiggy

反白条带出现，大概率是你蛋白浓度太高，出现了烧心现象，还来不及拍照,大量的辣根过氧化物酶就反应了,把发光试剂消耗掉了，从而没有光了。

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问请问外泌体的生物标志物如何选择，如何鉴定啊？

vae1476

正好最近在做，外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族（CD63、CD81和CD9)）、热休克蛋白家族（(HSP60、HSP70、HSPA5、CCT2和HSP90)以及一些细胞特异性的蛋白包括A33（结肠上皮细胞来源）、MHC-II(抗原提呈细胞来源)、CD86(抗原提呈细胞来源)以及乳凝集素（不成熟的树突状细胞）。其中CD63、CD9、CD81以及TSG101、HSP70、ALIX等，是最常

3 回答1102 围观

问蛋白质样品可以反复冻融吗？

迟C迟

蛋白样品不建议久存，也不要反复冻融。下游做WB实验，建议蛋白浓度测定后，加入loading buffer煮样，煮后根据实验需要分装成小管在-80℃，下次使用前拿出小管再次煮样即可。

6 回答3980 围观

问各位前辈，WB蛋白定量怎样缩短时间呀？我总是1个多小时，太耗时间。

天一湖医者

蛋白定量法开始之前我们有必要复习一下理论知识。蛋白定量至少有 5 种方法： BCA，Bradford，双缩脲法（Biuret 法），Folin 法（Lowry 法）和紫外分光光度计法。BCA 法的原理是在碱性条件下，氨基酸将二价铜还原为一价铜与 BCA 形成紫颜色的络合物，测定 562 nm 的 OD 值，所以如果样本里有还原剂（比如 DTT）的话就会对 BCA 的结果产生干扰。Bradford

5 回答327 围观

问一个新蛋白，制备多克隆抗体时，抗原设计表达重组蛋白选择的氨基酸序列原则是什么？

vae1476

分析蛋白性质性质和特点，根据实际应用目的制定抗体，有以下原则：1）基本性质分析:查看蛋白质修饰情况（糖基化、羟基化、磷酸化、甲酰化等）、结构域特点、剪切加工等情况，如果蛋白质有后加工，应该尽可能选择一个完整“成熟体”区段进行分析。常用网站：(Http://www.uniprot.org)。2）分析跨膜区分析：进行跨膜分析最常用的网站（http://www.cbs.dtu.dk/services/T

3 回答384 围观

问WB条带模糊，有很大的阴影盖住条带，什么原因？

迟C迟

是出现非均一性背景吗？可能是你的膜曾经干过，在每一步操作过程中，都需要注意不让膜干。

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问如何提高筛选出标记蛋白

小刘小刘世界一流FVJ4

这个问题信息量太少了，你如果已经标记好了，还是荧光标记，那就去看荧光，如果想得到这个纯化蛋白，那就去层析，

3 回答321 围观

问请问有做磷酸化的蛋白，造模时间不同，做出来结果完全相反的吗？

whilt-shirt

首先得确定造模是成功的，建议重复试试

4 回答214 围观

问如何确定WB结果中目的蛋白位置高于预测位置的原因

whilt-shirt

可以通过更换不同的marker来确定

5 回答907 围观

问银染和WB哪个灵敏度更高？

迟C迟

银染的灵敏度高，但是有时候操作不好胶就变成大花脸了。

3 回答1424 围观

问想请问一下大家，检测磷酸化蛋白表达量变化的WB实验，除了加磷酸酶抑制剂之外，怎么操作可以让磷酸化蛋白更好跑出来呢？

Kimser

因为磷酸化是个可逆过程，所以除了磷酸酶抑制剂，还需要跟时间赛跑，新鲜和短时间流畅的操作会减少磷酸化的变化。当然，抑制剂仍然是关键所在，不过要注意对不同蛋白，磷酸酶抑制剂也不同。

3 回答1110 围观

问WB条带周围总是黑黑的一团，不知道怎么回事

未来9

可能的原因①膜封闭不够，建议延长封闭的时间；选择合适的封闭液。②一抗稀释度不适宜，太高，选择最适宜的抗体稀释度。③ 一抗孵育的温度偏高，建议4℃过夜孵育。④选择的膜容易产生高背景，一般NC膜的背景会比PVDF膜低，但是NC膜吸附力也就差了一点。⑤膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过，实验过程中要注意保持膜的湿润，使用镊子夹取膜。⑥检测时曝光时间过长，可减少曝光时间。

3 回答6302 围观

问为什么WB条带一个位置总是有两条，只敷了一种蛋白？

whilt-shirt

可能是抗体的特异性不好，也有可能是抗体浓度过高

5 回答1104 围观

问跑出来的带总是弯弯曲曲的怎么处理？

bamboopiggy

灌胶匀一些，或者低电压跑慢点，或者用软件拉直。

4 回答361 围观

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