实验问答22,776,055 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问WB条带每次曝光的时候条带边缘都有黑色的一圈是什么原因？

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第一建议用5%脱脂奶粉封闭，有条件的话封闭过夜，室温下至少封闭1小时。第二你一抗二抗稀释液应该都用含脱脂奶粉的来配，这样可以降低背景。第三这种现象我也遇到过，很可能是你一抗或二抗刚刚稀释之后，没有混均匀，然后就把膜放下去了。有的时候局部浓度特别大的时候，会造成严重的非特异性结合。第四洗膜不需要洗那么长时间的。一般洗3次，每次6~7分钟就可以了。敷完二抗之后洗3次，每次10分钟，

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问在样本制备和加样的过程中，所有会影响蛋白上样量的可能因素有哪些？如何提高蛋白上样量？

未来9

1、影响因素：样品浓度，蛋白裂解是否完全2、可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的，建议尽量不超载加样。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，以增大上样孔体积，可以试1.5mm厚的胶。

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问加药处理细胞，收集细胞提总蛋白跑WB，漂着的细胞要不要收集？收和不收对结果影响大吗？

米米米小喵

死细胞离心去掉，处理细胞时摸好条件，尽量不要让细胞死的太厉害，细胞增殖受到抑制的组可以少加点裂解液，方便调齐。

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问为啥我跑的BCL-2 ，缺复氧组比对照组还多

A9032

建议重复实验，同时关注BAX，以及BCL2/BAX比值，BCL2的磷酸化水平的改变。

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问蛋白纯化有杂质怎么办？

bamboopiggy

可以在上柱前，多离心几次，去掉杂质，如果是杂带的话，就挂柱以后，多洗几次。

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问求助：wb蛋白条带位置不对

bamboopiggy

你看一下cst说明书里，wb的条带在哪里，其实你只要跑过全膜，确定了你的位置，即使位置和预测的不一样，也是可以的，就是你的这个位置有点寸，咋感觉是你的lysis没有打开到一级结构，还是二聚体的感觉。因为40-50，70-100正好是二倍的感觉

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问BCA测蛋白浓度，溶液变蓝色是为啥呀，我看标准品都没有蓝色

JCorona

你想说的应该是标准品变成紫色，而样品变成蓝色对吗？我也遇到过这种情况，我推测是显色反应受到目的蛋白氨基酸序列中四个氨基酸残基（半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸和色氨酸）的影响。其实也不用太纠结这个，检测波长别弄错，标曲没问题就行了，这个本来就是测个大概，精确度没那么高的

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问P65和它的磷酸化问题

bamboopiggy

total的蛋白和磷酸化的一个趋势，这个是很常见的，你可以和内参比，只要p65磷酸化了，就是说明起作用了。

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问请问这块胶是什么问题啊，分离胶没凝好吗？

智明在寻找春娇的路上一去不复返

看marker的话整个胶应该没问题。可能是上样量比较多用ripa稀释下看看？

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问用慢病毒包装的方式做基因敲降，病毒滴度低，感染THP-1细胞，用puro筛选后，大部分细胞死掉了，怎么样提高病毒滴度？

喵喵喵柏

Thp-1不好转染，亲测原代细胞好转。建议重新摸puro的浓度，可能是浓度的问题，设置浓度梯度，看细胞死亡的数量。病毒滴度是包装病毒的厂家设计的，有不同种的浓度，这个应该和厂家沟通，或者提高加入病毒的量，并调整转染病毒的试剂的含量，及时换液

3 回答1160 围观

问杂同一个蛋白的兔抗和鼠抗为啥结果不同？

迟C迟

首先，兔抗血清通常含有高亲合力抗体，可以比鼠抗血清识别更多种类的表位。其次，兔单克隆抗体能够以识别许多在小鼠中不产生免疫的抗原。

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问WB最后条带曝不出来以及背景颜色很黑

迟C迟

背景黑考虑1.减少蛋白的上样量2.缩短曝光时间3.如果是化学发光，请减少超敏液的使用

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问蛋白纯化有杂带怎么办

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如果是his标签的话，首先与填料结合时使用的buffer里可以加点咪唑这样可以减少特异性结合，其次洗脱的时候可以适当提高咪唑浓度，加强对杂蛋白洗脱，最后就是更换填料的类型。以上只是对his标签蛋白提纯的优化，希望有帮助。

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问慢病毒包装一个细胞可以进几个载体？细胞和包装系统的量怎么确定？一个细胞可以包装几个病毒，包装病毒后细胞会裂解吗？

bamboopiggy

这个要看你的包装系统是几质粒的，例如2代包装体系就是3质粒的，3代是四质粒的。然后这些质粒都要进入细胞才能完成包装。至于包几个病毒，要看你的操作水平了，水平高，病毒滴度就大。包装病毒后，细胞不能裂解，裂解了，就死了，没法产毒。

2 回答876 围观

问代谢组学的数据怎么分析

天一湖医者

代谢组学分析数据用于统计分析时，数据集通常为一个N × K的矩阵（X矩阵），N表示N个样本数，每一行代表一个样品， K表示K个变量，每一列代表一个变量，在代谢组学中变量通常是指代谢物含量。最常用的分析方法如图

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问蛋白纯化时超声多久以及功率多大比较合适？

迟C迟

保持低温，400W ，工作5秒间隔5秒，大概重复10-20次吧。

3 回答3348 围观

问有什么好用的软件根据氨基酸顺序构建蛋白质结构，计算蛋白质结构域，预测功能。

bamboopiggy

alphafold2和roseTTAfold两个是近期最火的。咱们国内的uni-fold，都是可以预测的。还有I-tasser，quark，swiss-model等。

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问WB条带扭曲可能得原因有哪些

天一湖医者

电泳电流不均一，建议换电泳槽，或者不使用两边的孔。

4 回答2735 围观

问SDS-PAGE制胶的过程中发现分离胶底部总是出现花纹，而且影响跑胶结果，是什么原因呢？

bamboopiggy

我以前也遇到过，不要把你的目的蛋白跑的太往下，在还没有变形之前就停止电泳转膜，我当时是因为电泳槽的金属丝不好了。最下面的蛋白往两边分。

3 回答1009 围观

问膜蛋白怎么变性比较好？

bamboopiggy

蛋白一般还是要通过95-100度，煮一下来变性打开的，如果膜蛋白比较脆弱，考虑lysis里加蛋白酶抑制剂，并且将煮样时间缩短为5min

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