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P65和它的磷酸化问题
bamboopiggy
total的蛋白和磷酸化的一个趋势,这个是很常见的,你可以和内参比,只要p65磷酸化了,就是说明起作用了。
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问
请问这块胶是什么问题啊,分离胶没凝好吗?
智明在寻找春娇的路上一去不复返
看marker的话整个胶应该没问题。可能是上样量比较多 用ripa稀释下看看?
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问
用慢病毒包装的方式做基因敲降,病毒滴度低,感染THP-1细胞,用puro筛选后,大部分细胞死掉了,怎么样提高病毒滴度?
喵喵喵柏
Thp-1不好转染,亲测原代细胞好转。建议重新摸puro的浓度,可能是浓度的问题,设置浓度梯度,看细胞死亡的数量。病毒滴度是包装病毒的厂家设计的,有不同种的浓度,这个应该和厂家沟通,或者提高加入病毒的量,并调整转染病毒的试剂的含量,及时换液
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问
杂同一个蛋白的兔抗和鼠抗为啥结果不同?
迟C迟
首先,兔抗血清通常含有高亲合力抗体,可以比鼠抗血清识别更多种类的表位。其次,兔单克隆抗体能够以识别许多在小鼠中不产生免疫的抗原。
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问
WB最后条带曝不出来以及背景颜色很黑
迟C迟
背景黑考虑1.减少蛋白的上样量2.缩短曝光时间3.如果是化学发光,请减少超敏液的使用
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问
蛋白纯化有杂带怎么办
dxy_qm66y5m7
如果是his标签的话,首先与填料结合时使用的buffer里可以加点咪唑这样可以减少特异性结合,其次洗脱的时候可以适当提高咪唑浓度,加强对杂蛋白洗脱,最后就是更换填料的类型。以上只是对his标签蛋白提纯的优化,希望有帮助。
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问
慢病毒包装一个细胞可以进几个载体?细胞和包装系统的量怎么确定?一个细胞可以包装几个病毒,包装病毒后细胞会裂解吗?
bamboopiggy
这个要看你的包装系统是几质粒的,例如2代包装体系就是3质粒的,3代是四质粒的。然后这些质粒都要进入细胞才能完成包装。至于包几个病毒,要看你的操作水平了,水平高,病毒滴度就大。包装病毒后,细胞不能裂解,裂解了,就死了,没法产毒。
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问
代谢组学的数据怎么分析
天一湖医者
代谢组学分析数据用于统计分析时,数据集通常为一个N × K的矩阵(X矩阵),N表示N个样本数,每一行代表一个样品, K表示K个变量,每一列代表一个变量,在代谢组学中变量通常是指代谢物含量。最常用的分析方法如图
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问
蛋白纯化时超声多久以及功率多大比较合适?
迟C迟
保持低温,400W ,工作5秒间隔5秒,大概重复10-20次吧。
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问
有什么好用的软件根据氨基酸顺序构建蛋白质结构,计算蛋白质结构域,预测功能。
bamboopiggy
alphafold2和roseTTAfold两个是近期最火的。咱们国内的uni-fold,都是可以预测的。还有I-tasser,quark,swiss-model等。
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问
WB条带扭曲可能得原因有哪些
天一湖医者
电泳电流不均一,建议 换电泳槽,或者不使用两边的孔。
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问
SDS-PAGE制胶的过程中发现分离胶底部总是出现花纹,而且影响跑胶结果,是什么原因呢?
bamboopiggy
我以前也遇到过,不要把你的目的蛋白跑的太往下,在还没有变形之前就停止电泳转膜,我当时是因为电泳槽的金属丝不好了。最下面的蛋白往两边分。
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问
膜蛋白怎么变性比较好?
bamboopiggy
蛋白一般还是要通过95-100度,煮一下来变性打开的,如果膜蛋白比较脆弱,考虑lysis里加蛋白酶抑制剂,并且将煮样时间缩短为5min
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问
IP用多克隆抗体结果能行吗?
vae1476
可以用的,而且有些情况下,由于能识别多个表位,多克隆抗体可在IP/ChIP中得到更好的结果。
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问
请问WB跑出来的条带跟目的条带大小有偏移是为什么?
vae1476
1. 确定蛋白是内源的还是外源的,如果是外源蛋白是不是全长序列;2. SWISSPROT 数据库查询该蛋白是否有其他 isoform;3. SWISSPROT 和文献查询蛋白质是否有剪切活化,剪切活化造成蛋白变小;4. 确定蛋白质是否是二聚体或多聚体。5. NCBI 和 SWISSPROT 查询蛋白质表达后是否有修饰,如有修饰会导致蛋白质增大;
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问
WB曝光选择电子照胶仪好还是胶片曝光好?利弊分析?
迟C迟
个人认为用胶片还是比较稳定的,而且灵敏度要比电子显影的方法高一些,对于一些比较弱的带来说比较适合,还有就是感觉背景好一些。
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问
凝胶过滤层析相关的问题
vae1476
样本本身杂质太多或者层析柱污染,都有可能造成这种情况
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问
wb和免疫组化可以用同一种抗体吗,抗体怎样保存最好。
迟C迟
可以到卖抗体的公司网站上查一下适用实验。抗体可以保存在50%的甘油存放于-20℃。也可以将其保存在饱和硫酸铵于4℃或-20℃保存。
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问
我想问一下一抗以及二抗和抗原结合的原理,以及有没有什么办法提前检验抗体质量。
whilt-shirt
一抗是针对抗原的抗体,二抗是针对一抗的抗体。即抗体也可以充当抗原刺激机体产生抗体。也就是说,抗原进入机体刺激机体免疫系统产生免疫应答,由B细胞可以产生与相应抗原发生特异性结合的特殊蛋白质。一抗二抗都是一种可以特异结合别的物质的基团,而且一抗可以至少结合两种其他基团(底物和二抗)
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问
WB时为什么跑出来的条带总是斜的
迟C迟
主要可能是电泳凝胶配制时未搅拌均匀,造成条带未能直线跑完,电泳凝胶中混入气泡,造成条带被挤压倾斜,也可能是样品和缓冲液有干扰,造成条带迁移率不统一,另外上样量过大,被其他泳道挤压也有可能。
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