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科研学霸天团,48小时有问必答
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PD-1的流式抗体要怎么选择?
balalaLy
一种抗原就对应一种抗体(各种剪切体、修饰后的另说)
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问
融合蛋白之间,可用两个酶切位点代替linker吗?
Miracle星
不可以的简单的说:1.要遵循引物设计的基本原则,,重组表达的引物相对容易设计一点(因为位置固定); 2.目的产物是:蛋白1+linker+蛋白2,则需插入载体的目的片段为“酶切位点1+蛋白1+linker+蛋白2+酶切位点2”3.那么想获得这个目的基因片段,则需要设计4个引物,分两步进行。1)引物:P1——> 5'- 内切酶1+蛋白1上游 -3' (正向序列)
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问
免疫共沉淀实验,总是假阳性,该如何避免
天一湖医者
免疫沉淀的假阳性一般來自洗过的免疫沉淀物中存在的某些蛋白质,这些污染物在完整细胞内不与目的蛋白相互结合,但在细胞裂解后可形成非生理条件的蛋白质与蛋白质的相互作用,也可能来自抗体与其他非目的蛋白的交叉反应,(这在做western很常见),或者非特异性反应.为了排除这种假阳性可采用几种方法:一是采用几种不同抗体.如用几种不同的cmyc抗体去IP,可增加结果的可信度,另外也可以采用对照抗体,如与你的抗体
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问
看不到自己目的蛋白处有增高的趋势?
汤姆卜丽波
你是合成重组质粒然后转到细胞里的么,质粒测序了么,FLAG标签确定加上了么?如果确定加上了,那有可能是转染,后面一系列操作,一步一步看,都确定没问题了就只能重跑了
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问
NF-kB的激活验证
balalaLy
核浆分离提取蛋白,比较核内外蛋白量,提取总蛋白比较磷酸化和非磷酸化
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问
NF-kB活化的验证
汤姆卜丽波
我们测的都是核内,还是核内稳妥一点
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问
为什么我的样品,头一天还可以在显微镜下观察到荧光,第二天就一点也看不到了
whilt-shirt
这是荧光猝灭了,在加完荧光试剂后要加荧光抗猝灭剂
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问
请教兔样品做wb选择抗体问题,感谢!
bamboopiggy
用兔做wb的确实少,但是要记得你有对照组,如果实在找不到合适的鼠源的抗体,可以用兔源的。但是如果reactivity里没有写兔,确实有风险,但是不试,也不知道会不会有反应。你可以考虑找公司要试用装,现在国内的抗体公司可以申请试用装。
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问
wb LC3怎么跑才好看啊,我每次跑的都很丑,感觉很弥散,不清晰。
bamboopiggy
用15%的胶,不要跑的太低,大概留住10的marker,就转膜。
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问
膜蛋白的提取效率低,而且检测到大多数为阶段后的蛋白
汤姆卜丽波
以下是提膜蛋白的protocol, 有些注意要点,是不是没有注意到, 1.将离心管柱及接收管套管放置冰上预冷。 2.细胞样品,贴壁细胞样品建议使用细胞刮刀收集,尽量不使用胰酶消化,细胞量为 20-50 X 106 个细胞。 3a.用预冷的 PBS 清洗一次细胞。Buffer A 中重悬细胞(起始细胞数小于 5X 106 加入 200ul Buffer A,起始细胞数大于 5X 106 加入
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问
配SDS-PAGE胶时 ,用无水乙醇封,残余的无水乙醇会对胶有影响吗?
whilt-shirt
会导致上层胶与下层胶之间出现气泡,并且胶不匀
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问
BCA测蛋白浓度时,我的样品比标准品晚了几分钟加,会有什么影响吗
天一湖医者
这个一般来说是不会有什么影响的。
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问
WB显影时,marker也一起被显出强光是什么原因呢,怎么避免?
天一湖医者
可能有以下原因:一抗是单克隆吗?如果不是,那么多克隆抗体时会产生你说的那样的结果的!
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问
WB内参两条带?换内参吗?
秋秋欣欣
可能是胶配得有问题也有可能是样品的问题
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问
想请教WB半干转的电流和时间怎么选择
bamboopiggy
你用的什么公司的机器?公司应该给说明书了,按照说明书来调就好。大分子量的,就时间稍微长一点,小分子量的,时间可以稍微短一点。
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问
老师这个蛋白打下去时候就成团,不好看,什么原因啊
balalaLy
图片看不清。成团的话,可能是loading buffer太粘稠,或者是蛋白液中杂质比如核酸没有去除干净。
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问
各位老师我想问一下WB电流大小是与膜的面积有关吗? 这怎么算膜的大小面积?然后用多少ma电流啊?
bamboopiggy
你是说转膜的电流吧?这个和你的机器有关系,和你膜的面积的大小关系不大,你买的是湿转的,还是半干转的?问买的业务员,可以用多大电流。
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问
想请教一下各位大佬,胶倾斜是什么原因呀?
bamboopiggy
你灌的不匀,所以积层胶和分离胶之间没有压住
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问
如何证明三个蛋白能形成三聚体?
bamboopiggy
首先用co-ip,a能拉下b和c来,b能拉下a和c来,c能拉下ab来,然后跑native 胶,三聚体的大小应该是三个蛋白分子量的总和。
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问
用于酵母双杂交转化的质粒质量要比较高吗?
天一湖医者
是的,用于酵母双杂交转化的质粒质量要比较高。
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