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WB实验显色或曝光后无条带原因在哪儿?
Eason老歌迷
可能有几个原因,一个是你的转膜没转好,或者是转膜时间太长转过了。二个是你剪膜直接把目的条带剪掉了。三可能是你孵抗体没孵好,或者是一抗二抗选错了。四可能是你的显影操作有问题
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问
Western blot实验时背景高且不均匀怎么办?
天一湖医者
封闭物用量不足,提高封闭浓度,使用适当体积保证孵育时完全覆盖。转印膜封闭物使用不当,检测生物素标记的蛋白时,不可用脱脂奶封闭。封闭的时间不够,延长封闭时间,抗体非特异性结合减少,抗体的浓度和孵育时间抗体浓度过高或洗涤不彻底,降低抗体浓度,增加洗涤时间和次数化学显色底物过多减少显色底物用量
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问
WB实验时目的蛋白信号弱怎么办?
林夕娜娜
1.加大上样量2.使用高灵敏度的发光液。
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问
westernblot配胶问题
Eason老歌迷
没啥区别,我都是用过的。之前用无水乙醇,后来该用的水。无水乙醇效果更好一丢丢
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问
wb检测蛋白时,过曝的话,结果还可信吗?
Eason老歌迷
建议你重新跑吧。要么降低一下你的上样量,或者是稀释你的抗体倍数,或者是减少你的曝光时间
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问
买的抗体,说明书里图片显示目的条带只有一条,而自己做wb,却有多条带,什么原因呢?
balalaLy
有些时候是会这样,要调整一下抗体的浓度、稀释液、还有孵育时间。
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问
WB检测蛋白,条带大小与理论大小不相符,什么原因?
Eason老歌迷
如果蛋白大小和预测值有明显倍数关系,那就要考虑一下这个蛋白是不是二聚体或者多聚体啦。
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问
WB实验跑出来的目标条带信号很弱是怎么回事
青柠清心
提取蛋白质过程中,应在低温环境下进行,以抑制蛋白酶的水解作用(可加入适合的蛋白酶转移不完全或过转移,可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流抑制剂)。一抗孵育时间不足,建议4℃结合过夜,或者是由于二抗与一抗不匹配,选择针对一抗来源的种属的抗体。 洗膜过度,洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-2
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问
每次曝出来的片总是中间空心,想不通是为什么
Eason老歌迷
可能是你转膜的时候,你的膜和胶之间有气泡,你没赶走。
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问
BCA调完上样内参还是不齐什么原因
Eason老歌迷
调整上样量,如果还是调不齐,建议做灰度扫描,将目的蛋白的灰度值比上对应的内参,这样比较准确,目前很多文章的western图都会附上相应的灰度扫描结果,这样更加定量和直观。或者你配的胶的问题,可能没凝好。
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问
有两个Mix混样,在计算差异表达蛋白时如何使用?
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问
用BCA法测蛋白浓度的时候总会存在调平失败的状况,有的时候甚至不如不调,有什么小技巧让调平更稳一些吗
balalaLy
如果组间蛋白量差异比较大的前提下用BCA法定量是会有比较大的误差,所以尽量取细胞数差不多的,或者组织重量相近的。
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问
WB转膜用的膜有什么差别吗?实验室有两种,一个孔径大于20um,一个小于20um,但是有人说可以通用
秋秋欣欣
主要是看你的蛋白大小,如果你的蛋白很小最好用小孔径的,如果蛋白较大则需要用大孔径的膜
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问
之前听说煮好的蛋白放-80度和-20度都行,那具体可以放多久呢
三千123
-20度可以放一个月左右,-80度可以放半年左右,对于反复冻融的存放时间要缩短。
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问
蛋白疏岁水性较强,需要加助溶剂才能提取出来?
Eason老歌迷
既然是提取那肯定是有沉淀和上清,目标蛋白的分子量是应该知道的,那么跑电泳先看它到底是在上清还是沉淀里,剩下的问题你再解决如何提取。对于不同的酶要看酶稳定如何,可以用不同的PH去提取,曾经提取一个酶用水就是提取不出来,需要用盐才能提取出来,多试试,设计个方案,这样才能解决问题,所以不一定加甘油就管用,还得注意破碎本身会不会有问题,倒回去做做也许能找到真正的原因。
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问
通过 iTRAQ/TMT 实验筛选到的差异蛋白,如何挑选验证?
Eason老歌迷
如Western blot、ELISA 、PRM(平行反应监测),该方法是基于靶向的蛋白质组学,研究特定蛋白的表达变化。也可以用代谢组学,基因组学等多组学互相验证。
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问
请问背景颜色深,目的蛋白颜色浅是因为什么?
Eason老歌迷
可能是你的封闭没有封闭好,也可能是目的蛋白表达量太少了,或者是你转膜没转好
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问
蛋白免疫印迹实验抗体孵化时间多长?
dxy_xm5w7hg4
一抗过夜,二抗一小时通常,如果想快点,一抗2小时,二抗一小时
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问
蛋白质免疫印迹实验转染时间多长?
Eason老歌迷
你说的是转膜?转膜看你是半干转还是湿转,半干转快30分钟,湿转可能1-2小时
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问
蛋白质免疫印迹实验总蛋白量多少?
inventbiotech
每个孔至少要10-15ug,如果目标蛋白在总蛋白中丰度低,还需要加大上样量。重要的是总蛋白样品制备时蛋白没有丢失,否则上再大量的蛋白样依然是检不出。尤其目前大部分总蛋白的制备用RIPA来制备,其实ripa只提取RIPA可溶性蛋白,ripa提取总蛋白丢弃部分还是有很多蛋白的,细胞核和细胞器以及细胞膜上的蛋白大部分因为不能溶解在RIPA裂解液里,所以这些组分大部分会在RIPA不可溶性组分里。总蛋白提取
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