重叠pcr连接长片段(7kb左右)一直做不出来 有没有大佬可以请教一下
dxy_u05xib55
一个片段5200bp左右，第二个片段1400bp左右，重叠碱基20bp，用的是KOD FX酶，退火56度30S，延伸68度7分。后来扩增一段重叠区与第二片段连上了， 两个片段做重叠，大概有1100Bp的重叠，但是还是不行，跑出来的条带一直都是这样。
2 个回答
土井挞克树
在做重叠延伸PCR时，要注意一个关键的问题，如果你用Taq酶话，会在扩增产物的3‘端多一个A尾，如果你其他条件都没问题的话，就要考虑一下是不是这个A尾影响了碱基配对的问题，可以换用平末端酶（如pfu酶）一试。
huarenqiang5
1、DNA模板质量问题，没有提取到含有足够量目的基因的完整模板，如发生这种情况应该提取新鲜的样本或者对核酸提取使用比较温和的方法来降低提取过程中的损伤情况。
2、本身基因型具有差异性的样本导致扩增失败，设计有缺陷的引物，会出现二聚体、非特异性扩增甚至扩增失败，可以选择设计相对保守的引物。
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