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        基本方案

        相关实验:重叠延伸 PCR

        最新修订时间:

        原理

        重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1.  以引物a/b进行pcr1。

        2.  以引物c/d进行pcr2。

        3.  引物b/c中引入了需要的限制性位点。

        4.  混合二者pcr产物,混合以前最好回收一下。

        5.  进行pcr延伸反应,只有右面这个可以延伸。

        6.  以延伸反应的产物为模板,以a/d为引物进行pcr。

        7.  产物即为所需最终产物。

        注意事项

        尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一。因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意:


        1. 戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套;


        2. 使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染;


        3. 避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;


        4. 操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度;


        5. 最后加入反应模板,加入后盖紧反应管;


        6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性;


        7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染,最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器,至少PCR操作过程中加样器应该专用,不能交叉使用,尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区;


        8. 重复实验,验证结果,慎下结论。 

        来源:丁香实验

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