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        【求助】重叠延伸PCR技术扩增长片段

        丁香园论坛

        8333
        请问各位高手,我需要将1000多和2000多的两个片段连接起来,用重叠延伸PCR技术的方法怎么也连接不起来?(重叠碱基23个)总是扩增出1000多的杂带,没3000多的目的片段,原因可能是什么?希望大家给予指点!谢谢!
        你做extension overlap PCR的多么?

        不妨将完整的实验方法列上来,包括每步PCR的步骤和回收的步骤、方法~

        23bp我觉得确实还是有些勉强,尤其你的片段长,如果能排除别的问题,增加几个碱基更好啊
        首先,把1000多和2000多的两个片段变性后(如果能分离出单链,可能效果更好),不加两端引物进行PCR

        然后,再加1000多的上游引物和2000多的下游引物进行PCR(第一次那产物可能不需要太多,杂质多了PCR影响大。由于PCR指数扩增,模板量少在这里不是问题)

        当然,你用的所有试剂要有保证,比如要高保真的要扩增效率高的酶,一般的Taq酶work不了的...

        另外,重叠区23bp的Tm与退火温度要相应调整,如果能加长一点可能更好...

        每一个具体的实验,可能具体参数会有不同...

        Good Luck!
        在做重叠延伸PCR时,要注意一个关键的问题,如果你用Taq酶话,会在扩增产物的3‘端多一个A尾,如果你其他条件都没问题的话,就要考虑一下是不是这个A尾影响了碱基配对的问题,可以换用平末端酶(如pfu酶)一试。祝实验顺利!

        本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

        师兄微信号:shixiongcoming

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