实验问答21,848,631 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问提取多少核酸够用？

ULYSSEESWB

做预实验啊。。。提取rna至少需要6孔板级别的，至少2孔以上吧，细胞瓶绝对是够了

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问PCR 和原位 PCR 在概念上有什么区别？

phhcrab

原位PCR是Hasse等于1990年建立的技术，就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值。简单的说原位PCR的样品要像类似于组织切片那样先做下

1 回答1181 围观

问想问一下大家 PCR扩增时模板DNA是不是不能反复冻融那我该怎么用呢

我是金博士

有两个办法：1、分开装，每个管装一小部分；每次用就取一管，这是最好的。2、可以放4度冰箱的，但是注意冻融一两次以后就不要再用了。

1 回答2285 围观

问荧光定量 PCR 扩增曲线呈现锯齿状是什么原因？

elite_xy

锯齿，应该是一上一下吧，好诡异的曲线，好困惑的问题，从没见过，建议全套realtime试剂盒全换，或者用现有的试剂盒去另一台机器试试

1 回答1116 围观

问PCR 结果出现弥散现象的原因？

ziye_1988

有很多原因啊，比如说模板加的太多了，建议体系参考酶的说明书，具体原因和解决办法参照分子克隆上册PCR那一张（好像是第八章）~

1 回答1318 围观

问PT-PCR 两步法中为什么跑不出来曲线？

sean18

首先，应该是RT-PCR，不是PT-PCR。RT-PCR就4个基本因素模板、引物、PCR试剂及PCR条件。曲线一直都是平的，一点都没有，非常可能的一点是你的realtime PCR仪设置出问题了，滤片模式选择错误。

1 回答2571 围观

问引物间形成二聚体怎么办？

我是金博士

1、不能重新设计就试试降低一下引物浓度，调整一下体系如优化镁离子浓度或改变模板量。除此之外，形成引物二聚物的原因很多，如聚合酶是否活化，还有program，退火温度太高，时间太短，延伸时间太短都可能是原因。2、把循环中的退火温度提高，避免二聚体的形成。必要的时候，做两步PCR——退火和延伸都在70或72度进行。3、在设计引物时，在上下游引物的5'端加上序列一样的寡核苷酸尾巴，使得PCR进行到第三个

1 回答3344 围观

问PCR 实验中 dNTP 加过量会有什么影响？

我是金博士

dNTP可以与Mg2+结合，从而降低体系中Mg2+浓度，造成Taq的聚合活性下降。另一方面， dNTP过量，可以增大错误扩增的几率，导致出现非特异扩增产物和smear。

1 回答3583 围观

问为什么我的琼脂糖电泳跑胶总是出现笑脸或者皱眉条带？

我是金博士

不知道是啥笑脸图？如果说条带不均一，那很大程度上是配胶不均匀。我们一般都是微波炉中高热加热

1 回答3376 围观

问出现片状拖带或涂抹带该怎么办？

hellokitty5

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数

1 回答2299 围观

问PCR 检测阳性，酶切无带的克隆，测序是否有结果？

tao0129

这种情况下，最好不要送去测序，最好重新做连接。当然这种情况的出现有一种可能是细菌培养时间过长，导致质粒被甲基化修饰所造成的。此时，你只需重新培养细菌，重新提取质粒即可。但这种情况的出现，还有一种可能是PCR假阳性，尤其是在克隆片段较短时会出现。那么这时，你只能重新做连接。建议：干脆重新做连接还比较放心。注意：你的片段比较小，你酶切后的片段浓度能否在电泳后出现带，这一点你一定要弄清，你必须保证浓度酶

1 回答3372 围观

问在做 PCR 时比较合适的扩增产物片段长度是多少？

赵栋2012

没问题，但要注意保真性，也就是用高保真的酶或者采用分段扩增的办法。如有必要有条件，就测序验证。引物设计与你的目的片断长度似乎关系不大，其序列的特异性则是很重要的。有很多常规提高产物特异性的办法，就不一一列举了如果受到模办的局限，不妨采用巢式PCR之类的办法。

1 回答4515 围观

问荧光定量 PCR 扩增产物能否直接进行琼脂糖凝胶电泳？

赵栋2012

确切的说荧光定量PCR产物跑凝胶看到条带说明你的产物很理想，但看不到条带不能说就没有产物，因为荧光定量PCR反应过程并不是严格意义上的循环扩增过程，因为大部分都没有退火温度。

1 回答6339 围观

问为什么会产生弥散（smear）条带？

tao0129

原因：在PCR反应体系中第一链产物的含量过高。解决办法：1.减少引物的用量。2. 优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数。3. 在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。

1 回答4353 围观

问出现非特异性扩增带是何原因？

我是金博士

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或

1 回答4318 围观

问PCR 实验的扩增曲线为什么呈现直线型？

tao0129

原因：1.探针部分降解。探针降解原因：（1）探针反复冻融――稀释的探针可在4℃保存至少3个月，应避免反复冻融。（2）探针在光线下暴露时间太长。2.反应液中有PCR抑制物。

1 回答1439 围观

问如何估计 RT-PCR 扩增产物的大小？

tao0129

你设计的正、反向引物的起止序列编号之差就是扩增产物的长度，如果一段使用oligo（T）就加上它的长度就可以了。

1 回答3260 围观

问为什么荧光定量 PCR 的扩增产物长度不能太长？

tao0129

你说的这种Real-time PCR应该是通过Taqman探针检测的。Taqman探针为基础的Real-time PCR以引物和探针序列决定反应的特异性，而通过荧光强度判断探针降解程度，从而推断模板量。

1 回答5873 围观

问PCR 有条带，但是转化后再验证却出现假阳性？

我是金博士

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。　　引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。　　靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但

1 回答2339 围观

问PCR 时变性时间 15s 退火时间 15s 是否会对结果产生影响？

丁香通官方号

引物与PCR大小无关，基本上引物在20-30 bp。

1 回答1859 围观

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