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实验问答23,520,115 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

PCR

问PCR实验引物设计有什么要求？TM值一般多少最合适？

汤姆卜丽波

1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；2、引物GC含量一般为40%-60%， 45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近，一般Tm值不超过 5℃。3、引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间，最好为 72℃左右。4、引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任

5 回答23302 围观

问Pcr模板加的量太多会导致产物多条带，且不亮吗

bamboopiggy

按照你的酶的说明书来加pcr模板的量，加多了，会产生非特异性结合，产物条带多，且不特异。

3 回答4002 围观

问大家有没有扩长片段基因（16000左右）的酶和体系的推荐呀？

天一湖医者

这是最常规的PCR，随便用哪家的酶都可以。

4 回答511 围观

问以片段为模板扩增会导致产物品质降低吗

汤姆卜丽波

是会低一些，但是我们也有这样扩增过，还是能扩出来的

5 回答371 围观

问PCR程序设定是根据什么来的？

shanshan2113

pcr程序设定取决于：1.扩增酶的类型，决定变性温度，扩增效率等；2.扩增引物，决定退火温度；3.目的片段大小，决定延伸时间。

5 回答2742 围观

问定下引物的Tm值范围之后即可定下引物的长度范围吗？

shanshan2113

引物Tm值与引物序列GC含量有关，确定Tm值后，若GC含量高，则引物短，GC含量低，则引物长。

4 回答510 围观

问pcr实验，模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异？

社恐的阿宝

模板与引物之间解链温度的差异越小越好，越小效率越高

4 回答375 围观

问难道引物会突然不适用了吗

balalaLy

引一般引物稀释后保存在-20可以用挺久的，4度的话可能超过一个月就不敢保证了

5 回答533 围观

问rtPCR，药物、对照组设置问题

balalaLy

对，一块96孔板可以跑完。每个指标要分开，不能mix。如果你加样熟练手很稳的话，可以只做2个副孔。

5 回答449 围观

问PCR实验，PCR实验快速检验省去了提取试剂2的过程与正常过程检验总是结果不一致，是快速实验过程程序不对吗？

Eason老歌迷

PCR反应的关键环节有:模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及PCR循环条件。寻找原因应针对上述环节进行分析研究。你看看是不是省去的步骤导致的呢？

6 回答479 围观

问PCR实验过程中，不同厂家的试剂同一批标本做出的结果不一样复查也不一样是哪个环节的问题？

汤姆卜丽波

是指结果完全相反么还是有一定差异，都在保质期内的吧试剂？

5 回答466 围观

问PCR实验过程中，为什么同样的试剂会出现内标线不起，重新提取后内标起了实验结果还可靠吗？

Eason老歌迷

内标总是不出来的话，就是你操作中有个环节出问题了。阳性对照不出的原因很多，主要考虑试剂系统。内源性内标采用的是人的管家基因，存在于人的基因组中，可以监测核酸检测的全流程，包括取样，样本提取等。导致样本内标异常的原因很多，需要耐心分析，采样的质量，样本是否混匀，提取各步骤加样，八连管的匹配度，荧光收集是否正常都会影响结果。实验过程中需要足够的细心，数据分析时需要足够的耐心。检测的荧光吸收波长是不同的

4 回答1119 围观

问PCR过程中提取试剂1底物添加对实验过程影响多少？

whilt-shirt

你这个不太好回答，试剂1都不知道是什么

4 回答535 围观

问PCR过程提取试剂1在常温下可以留多久？

bamboopiggy

如果是DNA的话，室温放个半天一天的没啥大问题。

3 回答456 围观

问PCR反应过程中的假阳性假阴性怎么判读？

bamboopiggy

做好对照，加入阴性对照和阳性对照，就可以判断假阴性假阳性了。

3 回答2450 围观

问QPCR逆转录问题咨询

bamboopiggy

你可以再补点成20ul体系，加1000ng不就可以了。你加多了rna，可能会影响酶的逆转效率的。

3 回答682 围观

问PCR结果怎么看？如何区分真假阳？

dxy_oeu11rar

通过琼脂糖凝胶电泳可以看到pcr结果，设置阴阳对照可以区分真假阳性，通常情况下阴性对照设置成水对照，即体系中不加入DNA模板，如果阴性对照无条带，结果更加可信

7 回答1811 围观

问如何用购买的阳性质粒制作转基因含量0.01%的阳性样品？例如：已知一个35s质粒，86bp，5微克，干粉。

bamboopiggy

可以参考一下这个专利：https://patents.google.com/patent/CN1718743A/zh本发明公开了一种转基因烟草检测方法，包括(一)巢式PCR定性检测：获得可用于PCR反应的样本DNA，同时检测样本的花椰菜花叶病毒启动子调控序列CaMV 35s、根癌农杆菌终止子调控序列nos和抗卡那霉素选择标记基因序列NPT II，引物的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1至SE

3 回答365 围观

问为什么有一个基因，换了好几个高保真酶，也用了二步PCR（先45℃退火10个循环，再55℃退火25个循环）还是完全没有条带呀

whilt-shirt

有可能是引物问题，建议重新设计引物

4 回答429 围观

问为什么我用QPCR测端粒长度时阴性对照总是出现CT值？而且该CT值和加DNA后的CT相差并不大？

天一湖医者

主要看你的CT值大约是多少，如果很大（大于40循环）那么可以判定结果没有问题，如果跟目的基因的CT一致或者为其他CT值那么判断为模板造成的气溶胶污染或者其他外缘DNA造成的污染。另外你阴性对照加的是水，那么说明你做梯度稀释的时候用的也是灭菌水，这个做荧光定量试验是很不规范的，建议用专门的荧光定量稀释液去做。

3 回答1541 围观

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