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科研学霸天团，48小时有问必答

问是否可以对入噬菌体直接进行LA PCR反应?

未来9

可以的，可以直接对菌体直接进行LA PCR反应

5 回答372 围观

问对Mammalian cell或E. coli只进行热处理 98℃,2 min或Protease处理的样品可否进行LA PCR?

bamboopiggy

不太合适，因为模板这么处理不纯，LA pcr的结果会不好。

3 回答380 围观

问使用LA Taq是否也产生A的Overhang? （PCR产物是否可直接克隆于T-vector中?）

bamboopiggy

LA taq扩增得到的PCR产物的3’端常附有一个"A"碱基，可直接克隆于T-Vector中

3 回答337 围观

问如何在共有序列巢式PCR实验中减少假阳性？

天一湖医者

1.戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套;2.使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染;3.避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;4.操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,

3 回答669 围观

问PCR的循环数可以超过35吗？

未来9

一般不超过35次。随着反应时长加长，会导致非特异性产物相应增加产生干扰；另外设计实验的时候减少循环次数可以减少使用量缩短时间。

5 回答2025 围观

问PCR实验的酶该怎么选择？

未来9

根据考虑的指标，如特异性、灵敏度、扩增片段长度、能否进行复杂模板扩增以及优化条件难易等等,我们将主要的Taq酶归归类,其性质、用途也就一目了然了。

3 回答666 围观

问PCR的延伸温度是怎么调整的？

天一湖医者

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

3 回答4864 围观

问qPCR试剂盒放了一年还能用么？

未来9

可以的。荧光定量PCR试剂盒保存条件: 收到本产品后,请立即置于-20℃避光保存,一年有效。

4 回答1088 围观

问RT-PCR的数据处理方法如何选择？

未来9

常用的相对定量数据分析方法有双标曲线法， ΔCt法， 2-ΔΔCt法(Livak法)，用参照基因的ΔCt法和Pfaffl法。对比如下图：

3 回答1068 围观

问qPCR时，cDNA的浓度怎么控制在同一浓度范围？

天一湖医者

一般提取组织后测RNA的浓度，然后反转录的时候保证reaction mixture里面RNA的量是一样的。然后你反转录成了cDNA。这个时候不必要测浓度。因为你的反转录体系都是一样的，理论上讲（建议用multipipetide）你生成的cDNA也是一样的。

4 回答1463 围观

问qPCR重复性不好，怎么避免？

天一湖医者

造成qPCR实验重复性不好的原因有以下几点：① 移液枪不准，加样不准确这种情况下，我们可以更换性能更好的移液枪，扩大反应体积，将模板做高倍稀释，以大体积加入反应体系中② 定量PCR仪在不同位置温度不一样这个需要定期校准定量PCR仪③ qPCR预混液未混合均匀使用前应充分混匀qPCR预混液

4 回答1192 围观

问RT-PCR的体系的构成？

天一湖医者

PCR反应体系由寡核苷酸(引物)、4 种dNTP、Taq DNA聚合酶、靶序列DNA和PCR反应缓冲液体系组成。

5 回答788 围观

问乳液PCR有了解的么？

汤姆卜丽波

有专用的孔隙大，低吸附的枪头，用那种试试

3 回答1067 围观

问NEAT1基因有两个转录本，长的转录本是在短的转录本基础上的延长，这种情况下怎么设计针对短转录本的特异引物？

Eason老歌迷

NEAT1基因其实有两个转录本：NEAT1_1和NEAT1_2, NEAT1_1(3.7 kb in humans, 3 kb in mice)与NEAT1_2 (23 kb In humans, 20 kb in mice)的5’末端完全重合，两个转录本均只包含一个外显子，而且均留在核内。NEAT1_1多聚腺苷化，类似于mRNA，而NEAT1_2对paraspeckles至关重要，构成其“arc

3 回答775 围观

问RT-PCR结果中出现undetermined

汤姆卜丽波

是不是加样问题，惯性操作，加到那个孔样品不够了

3 回答671 围观

问引物稀释至1undefined浓度可以-20℃保存多久

汤姆卜丽波

两个月到半年之间，应该够用了。

5 回答665 围观

问三个复孔的error bar比较长是什么原因呢

未来9

error bar越长，表示组内数据越分散，方差越大～而反之，越短，则表示数据越集中。1、首先，先排除仪器的干扰，仪器使用时间长的话孔间温度会有略微的变化，而且光路采集也需要确认有无故障，排除之后就要考虑加样的问题。仪器的因素可能性比较小。2、不建议将模板加入反应液后分装，最后加引物的做法。这样操作是非常不严谨的操作，因为你没有证据证明分装后每个管内的模板量是相同的。但是引物、酶和水的量的要求没有

5 回答691 围观

问关于RT-PCR过程中产物如何检测？

汤姆卜丽波

pcr就是琼脂糖凝胶检测，很方便

5 回答523 围观

问qPCR实验中，目标基因没有起峰，其他的两个基因数据正常，可以确定是引物设计问题吗？

bamboopiggy

大概率是引物的问题，如果全部都没有起峰的话。

5 回答388 围观

问单链DNA可不可以qpcr,空白对照CT值很高是否异常

bamboopiggy

pcr的原理就是要双链DNA，所以不管是pcr还是qpcr需要的模板都是双链DNA。空白对照CT值高，可能是引物不特异，形成了引物二聚体。

4 回答1223 围观

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