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        qPCR重复性不好,怎么避免?

        相关实验:实时荧光定量 PCR(realtime PCR)

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        四月清风小兔

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        4 个回答

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        天一湖医者

        有帮助

        造成qPCR实验重复性不好的原因有以下几点:

        ① 移液枪不准,加样不准确

        这种情况下,我们可以更换性能更好的移液枪,扩大反应体积,将模板做高倍稀释,以大体积加入反应体系中

        ② 定量PCR仪在不同位置温度不一样

        这个需要定期校准定量PCR仪

        ③ qPCR预混液未混合均匀

        使用前应充分混匀qPCR预混液

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        汤姆卜丽波

        有帮助

        同一实验设计的所有样本需取材部位/时间完全一致。选取大小均一,生长条件和遗传背景一致的供试材料。 同一种处理严格按照实验设计,处理剂量一致。

        起始样本量尽量一致,不要超过试剂盒规定的范围。

        把控RNA提取的整个流程,防止RNA降解。

        跨外显子设计定量引物,使基因组序列不被扩增。

        选用具有去除基因组功能的RNA提取试剂盒。

        选用具有去除基因组功能的反转录试剂,消除基因组的影响。

        倍比稀释cDNA模板减少PCR抑制剂的影响。

        采用适宜的离心柱法试剂盒提取RNA,以提高RNA纯度。

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        bamboopiggy

        有帮助

        加样前混匀cDNA,用好一点的枪和枪尖。

        user-title

        未来9

        有帮助

        重复性差的原因有:

        1)加样误差导致,建议移液器定期校准,另外可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化。

        2)模板量低,建议提高模板量,使Ct值落在15-30之间。

        3)仪器长时间未校准,建议定期进行仪器校准保养。

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