实验问答21,929,636 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问铁子们，这种情况是为啥啊啊？我之前有跑过这些引物没啥问题，现在真的好多问题

麻黄连翘赤小豆

有多峰，可能引物时间放久了，看右边还有好几个问题，样本或者加样都可能会有问题，再者你用的染料是否冻融多次也要考虑一下

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问qPCR探针怎么设计

天一湖医者

（1）探针的 3' 端必须保护以防止其在 PCR 扩增时延伸。可以利用 3'-脱氧腺苷、2', 3'双脱氧核苷，插人 T 或猝火染料本身封闭 3'端的磷酸基。TAMRA 或另一个猝火物对 3'端的标记可利用氨基衔接物实现。也可利用氨基衔接物在合成后以寡核苷酸标记。该法适用于除 Cy3TM、Cy5TM、Cy5.5TM、HEX 和 TET 之外的所有染料。（2）探针的 Tm 值应当比扩增引物的

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问qpcr溶解曲线双峰

爱吃水稻的小呆瓜

可能原因有以下几点:1.样品有gDNA污染2.引物不够特异3.引物二聚体建议先跑琼脂糖电泳，看条带亮度和是否单一，之后再跑定量

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问化学试剂废液需要分开盛放吗？

龍B7TJ

化学试剂废液需要分开盛放，分类处置

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问实验室温度过高、过低怎么办？可以来空调吗？

bamboopiggy

在实验室监控项目中，不同的实验室对温湿度有不同的要求，大部分实验都是在明确的温湿度环境下进行的。在医学、生物化学、仪器校准、农业、建筑和电器等领域，实验室环境条件直接影响各种实验或检测结果，每项实验都需要准确可靠的监测仪器提供准确的环境参数数据。实验室需要合适的温度和湿度。室内小气候，包括气温、、湿度、气流速度等。对在实验室工作的人员和设备有影响。夏季适宜温度18~28摄氏度，冬季适宜温度16~2

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问实验室如何通风？何时通风？

Eason老歌迷

实验室通风有几个主要方法，通风柜是针对实验室实验人员经常做实验的区域进行局部通风换气的方式，这种是局部通风方式：在生成有毒气体较集中的区域进行通风。而另一种是全面通风：对实验室整体进行通风换气的方式。实验室通风简单来说就是针对室内有毒气体的技术。按照通风动力又分为自然和机械通风，以上两种就是机械通风。

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问实验室的采光如何控制？可以有阳光直射吗？

Eason老歌迷

实验室避免阳光直射!实验室宜采用荧光灯照明，可减少炫目的光，且灯管温度较低，发光效率高，使用寿命较长。荧光灯镇流器应用隔热、不可燃材料与可燃性顶棚或墙面材料隔开，且应注意通风散热。需要恒温的房间，应将荧光灯镇流器装在室外。

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问为什么qpcr可以不测RNA浓度用水补齐

whilt-shirt

qPCR不用模板浓度一样，因为后期数据处理时有内参作为对照

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问用山羊的cDNA为模板克隆，为什么blast结果会得到鹿的染色体？

jack劲

第一，你要在前面进行blast的界面，有一个选择物种的地方，手动输入自己物种。选择物种之后再进行对比这样一般没有其他的物种了。第二，确实有些基因组有一些相似性。你不能完全忽略。

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问多次稀释，内参基因（ct17、18）与目的基因（ct32、33）ct值相差大于10

n0y0j7

扩增效率ok的话，都可以接受吧。相对定量，本来就是相对比较高低，

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问为什么我的常规PCR跑胶结果最下面有两条带呀，最下面那两条又是什么东东呢😂，我的目的基因是1000bp左右的

jack劲

应该是引物二聚体最下面的，会呈模糊状态。而另一个可能是相似的扩增出来的条带，你在设计引物前最好是去ncbi上比对一下这样就不容易扩增到其他条带。

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问qPCR内参不整齐是有哪些原因呢？同一个内参的Cq值差值挺大，有的20几，有的30几？

凌晨三点Dxy

常见原因：①排枪与枪头不匹配，结合不严密，导致加样量不足/不均一；②使用排枪吸取内标混合液时，液体堵住了部分枪头滤芯，导致向裂解板加样时加样量不均一，甚至部分孔没有液体加入。解决方案：建议使用配套量程的枪头，移液器要慢放慢吸；分装试剂和加样时仔细观察液体是否打出。

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问Touch Down PCR?

bamboopiggy

touch down pcr本来就是为了更好的得到实验结果才加的pcr程序，不需要优化，一般你把 touch down的annealing temperature 设置从55-65之间，就可以。如果说你的primer的Tm值太高，也可以适当的把annealing temperature的范围提高一些

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问做定量pcr 的时候，跑出的数据要怎么计算相对值

bamboopiggy

用ΔΔct法，你直接套进去，然后放到excel里面处理就可以。

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问qPCR重复性和结果处理

bamboopiggy

1、实验性重复，是指每次实验，每个样品，针对每个基因要有最少三个复孔。不用12个，也不用重复三天。2、①这个都可以，看你想怎么处理。②3个复孔取平均值。3、你的实验结果可以，但是太费了，你只要做3个复孔，做一天就可以。

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问我是先设定名字，再跑定量，后面名字错了能改吗？

凌晨三点Dxy

看你用什么仪器了，有的仪器可以改的

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问我在做实时荧光定量PCR的时候，我是先设定好样品和目标名称，一共两个目标基因，两个内参。但是我跑完就变成一个内参，其中一个内参

bamboopiggy

可能是你设置的问题，一般的realtime pcr仪都可以在跑完后，设置样品和目标名称的。

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问qpcr这样的扩增曲线是可以用的吗

bamboopiggy

ct值在21-22之间，感觉可以，但是你的图形有点奇怪，没达到平台期，反而再次升高了。你的melt curve是什么样的？

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问RAW264.7巨噬细胞极化qPCR内参

bamboopiggy

raw264.7跑realitme pcr ，文献里有人用gapdh，有人用actin，我一般用gapdh

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问数据分析

dxywode

你先把几次试验的对照组的平均值设为1, 再把每个单独试验对照组的数值算出和这个对照组平均值的差异，就可以计算标准差了。这么简单的统计分析，用不着SPSS吧， excel就可以解决了。

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