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        构建病毒cDNA如何选择质粒载体?

        相关实验:质粒构建技术

        user-title

        dxy_5690cfnq

        实验需要构建戊肝病毒cDNA质粒载体,要求构建的质粒能够在细胞里复制和表达,需要载体满足哪些条件呢?或者有没有推荐的视频或者书啊?

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        3 个回答

        user-title

        sswei

        有帮助

        用作克隆载体的质粒必须满足如下几方面的条件:(1) 具有复制起点,这是质粒增殖所必不可少的基本条件,可使繁殖的细胞维持 一定的质粒拷贝数。(2)带有抗菌素抗性基因,最好具有两种抗菌素抗性基因,且 抗性基因内有若干单一的酶切位点,便于利用插入失活筛选重组体。(3)具有若 干限制酶单一识别位点,这样可以有选择地供带有不同末端的外源DNA定点插入。(4)较小的分子量和较高的拷贝数,小分子量的质粒易于操作,更能抵抗机械剪切 力的切割,可容纳外源DNA片段也更长(不超过15kb),且可有效地转化给受体细 胞;小分子量的质粒往往属于松弛型质粒,在细胞所拷贝数较高,扩增示回收率高。

        user-title

        土井挞克树

        有帮助


        第一步:首先看Ori的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)

        第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。

        user-title

        此用户已注销

        有帮助

        .1.构建DNA重组体的目的,克隆扩增/表达,选择合适的克隆载体/表达载体。

        2.考虑载体的类型:

        (1)克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小(大选大,小选小)。如<10kb选质粒。

        (2)表达载体据受体细胞类型-原核/真核/穿梭,E.coli/哺乳类细胞表达载体。

        (3)原核表达载体应该注意:选择合适的启动子及相应的受体菌,用于表达真核蛋白质时注意稀有密码子,糖基化修饰和阅读框错位等问题。

        3.载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不产生阅读框架错位。由此可以整理选择质粒做为载体的4点要求:

        尽量选分子量小的质粒,即小载体(1-1.5kb),这样质粒较稳定,不易损坏,在细菌里面拷贝数也多;

        一般使用松弛型控制质粒(relaxed control),其可自主复制,因此每个宿主细胞10~200个质粒拷贝,此对分子克隆有利。而严谨型质粒(stringent control),与宿主染色体同步复制,因此每个宿主细胞中只有一个或几个质粒拷贝。

        必需具备多种限制性内切酶切点,但每种切口最好只有1个;

        必需有易检测的标记,例如抗药性标记,蓝白斑试验等。

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