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科研学霸天团，48小时有问必答

问关于RNAi转染效率的问题

丁香实验

不知道你是采用反义核苷酸还是siRNA，是直接导入anti－sense或者siRNA片段还是采用构建干扰质粒的方法，如果是直接导入寡核苷酸片段，只能采用特定的干扰转染试剂，推荐Ambion公司的转染试剂，如果是构建的干扰质粒，则可以采用质粒通用转染试剂，比如罗氏的FuGENE 6，效果不错。上述两种试剂都可用于普通质粒转染，优点是操作程序简单，尤其是Ambion的细胞毒性小。我做过许多细胞株，包括

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问原核生物与真核生物翻译起始阶段有何异同？

丁香实验

相同之处：（1）都需生成翻译起始复合物；（2）都需多种起始因子参加；（3）翻译起始的第一步都需核糖体的大、小亚基先分开；（4）都需要mRNA和氨酰- tRNA结合到核糖体的小亚基上；（5）mRNA在小亚基上就位都需一定的结构成分协助。（6）小亚基结合mRNA和起始者tRNA后，才能与大亚基结合。（7）都需要消耗能量。不同之处：（1）真核生物核糖体是80S（40S+60S）；eIF种类多（10多

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问怎样用流式细胞仪来鉴定小鼠BMDC？

丁香实验

检测小鼠BMDC主要是从形态学和细胞表面分子两方面来鉴定我做的时候就做了普通光镜下形态、电镜（扫描和透射），另外检测了小鼠BMDC表面的共刺激分子如CD86、CD11、CD80。还做了MHC II类分子的检测，还有MHCI类分子的检测，这些分子在DC表面都不是特异存在的，在巨噬细胞、淋巴细胞表面也有表达，所以目前并没有非常特异性的方法检测你的细胞一定就是DC，但是从形态和表面分子的检测结合来看，效

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问细胞转染后总是污染，求指教

波儿小芒

我建议你换个液看看，看镜头里面的图片，不太像是典型污染。如果液体不澄清，背景脏，那可能真的是污染。没事儿，你正常换液，主要操作的时候别与其他细胞一起操作。每次换液的时候，先用双抗原液清洗一下细胞。就算是细菌污染也不太要紧，一般通过抗生素洗涤和换液频率都能够挽救回来。当然了，如果你的细胞不是很珍贵，那你要评估一下有没有挽救的必要。

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问流式细胞技术测定细胞内游离钙浓度为何要使用氯化钙？

LM0309w

1、流式细胞仪上的FL2-W FL2-A FL2-H 分别是做什么的？FL2-W是只检测荧光的脉冲宽度， FL2-H是指脉冲高度。通常在做细胞周期分析时应用，用于去除粘连细胞。2、流式同型对照怎样选择？同型对照（IsotypeControl）：使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。如果一抗是多抗，可以

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问流式中检测细胞表面和细胞内蛋白表达水平的抗体有何区别？

丁香实验

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问流式细胞仪检测细胞周期是否需要鸡红细胞作参照？

丁香实验

不用，标准微球做完laser alignment（光路校正）就可以了。尽量把微球的各色CV值控制在1.5以内。

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问流式与werstern的区别？

丁香实验

（1）Western 是检测蛋白表达的金标准，可用于检测细胞多种类型的蛋白；流式细胞术的方法多用于检测细胞膜蛋白，虽然也可通过Triton-X100给细胞打孔的方法来检测胞内蛋白，但对于分泌蛋白却是无能为力的；（2）Western测蛋白含量对抗体的量需要很少，一般1：1000左右，而流式对抗体的需要量很大，一般1：50（很浪费抗体）；（3）采用Western方法检测细胞蛋白含量的变化一般要有内参，

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问流式中检测细胞表面和细胞内蛋白表达水平的抗体有何区别？

丁香实验

抗体只是针对相应抗原的，至于是针对胞内还是胞膜对你检测来说并无明显影响，你只需要查清楚到底是针对哪一个部位的抗原的，应该是可以用同一种抗体进行检测的，在流式操作时只需注意：如果是针对胞内，则需要加破膜剂，让抗体能和相应抗原接触，否则就不需要了。

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问流式同型对照怎样选择？

丁香实验

同型对照：是指与MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光染色法，同型对照也应标记荧光色素，如IgG1 FITC、IgG2ａ、PE等。主要考虑了细胞的自发荧光、FC受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外，同型对照与MoAb所标记的荧光色素、浓度、F：P比值（标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值）应该相同为最佳，这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义，切忌使用与

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问构建的原核表达载体不表达我的目的蛋白是为什么？

cpu2004

做个mRNA，如果mRNA水平就有问题加融合伙伴，尝试在C端（优先）和N端加入融合伙伴，有时候是某些蛋白的mRNA在你的表达系统中不稳定

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问同源性太高的基因，如何设计 TALEN 靶点？

jiayitu

这个确实很大一部分都被敲除了，还有一些别人没做出来的，我这个就是这个项目组的。。

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问大肠埃希菌能使甘露醇，蔗糖，麦芽糖产酸产气吗?

云天昊

这个是应该是可以的

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问慢病毒在成纤维细胞过表达IL-32，看其对细胞增殖凋亡的影响体外，买现成的人成纤维细胞，若不建立稳转的细胞，能说明实验的有效性吗

yyygo

慢病毒在成纤维细胞过表达IL-32，看其对细胞增殖凋亡的影响，不进行稳转细胞系构建，也能说明实验的有效性吧对细胞增殖凋亡的影响短时间的3-4天可否满足如果可以就不必进行了，那个时间太长了要持续半年耗不起

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问大肠杆菌感受态细胞制备时的CaCl2浓度到底是多少呢？

我是金博士

我们用0.1 mol/L，参照分子克隆的来。用CaCl2·2H2O可以，只要浓度一样就行了。

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问细胞免疫荧光用 4% 多聚甲醛固定，1% BSA 封闭，这两步可以不要吗？省去会有什么影响？

stellaff

“加荧光标记抗鼠抗体（第二抗体）工作液20ul，混匀振荡置4℃/30分钟（时间不能超过）。”请问这步必须是4℃/30分钟吗？时间不能超过，如果超过了会有什么影响？” 二抗不一定就是4℃ 30分钟，我们经常采用室温下避光孵育1小时，这样也可以得到较好的效果。细胞免疫荧光是需要固定的，根据目的蛋白的不同可以选择多聚甲醛或者丙酮，一般固定20分钟。封闭也是需要的可以减少非特异性背景。

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问感受态制备过程中，如何将第一次离心后的菌体悬浮？

hellokitty5

有一个诀窍就是离心的速度不能太高，如果用大型的离心机，转速在3 500-4 000 rpm 5-10分钟就可以了，只要你能把菌体离下就可以，不要太长时间，这样你的菌会很松，加上一些CaCl2轻轻弹几下就开了，再慢慢弹，慢慢摇，包你很快做好。这是经验，试试吧。

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问蛋白如何获取？

我是金博士

重组获得哦，通过基因克隆，表达获得蛋白。

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问为何我提取组织 DNA 后，DNA 的纯度很低？

我是金博士

可以多管浓缩，最后过柱子的时候，把很多管的都集中到一管。

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问显微镜目镜和物镜多少倍可以看见血小板？

论文菌

看不到的，confocal 60倍油镜隐约能看到血小板

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