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间接IM―PCR (以神经肽Y的检测为例)【试剂与配制】（1）TBS：20mmol/L Tris-HCl（pH7.4），150mmoI/L NaCL（2）封闭液：1.5％ BSA （用TBS配制）（3）抗神经肽Y单抗（4）兔抗神经肽Y抗体（5）生物素化羊抗兔IgG（6）亲合素（7）DNA指示分子(生物素―AdAT)（8）PCR反应液：5×PCR缓冲液10μl，dNTP 4μl，引物4μl，EP- ...

直接IM―PCR (以rhIL-3的检测为例)【试剂与配制】TBS：20mmol/L Tris-HCl（pH7.4），150mmoI/L NaCL封闭液：1.5％ BSA （用TBS配制）抗hIL-3单抗生物素化羊抗鼠IgG亲合素DNA指示分子(生物素―AdAT)PCR反应液：5×PCR缓冲液10μl，dNTP 4μl，引物4μl，EP-DNA聚合酶0.5μl蒸馏水31.5μl【操作方法】 ( ...

免疫PCR(IM-PCR)注意事项 (1)固相载体的选择：主要取决于抗原在固相载体上的吸附程度。如果抗原吸附良好，可以进行IM-PCR。如果抗原吸附不良，则需选用双抗体夹心IM―PCR。另外选用的固相载体要和PCR仪器相匹配。一般用0.5ml的塑料反应管，也可以用微量滴定板。 (2)待检抗原的特异性抗体：这是决定本法特异性和敏感性的关键试剂，使用相应的McAb为宜。将抗体进行生物素 ...

内参照定量PCR PCR可分析极微量的DNA，并可同时扩增多种序列，已应用于基因转录水平的研究。尽管PCR是一种较理想的核酸定量方法，但实验方案的选择对PCR定量的成功与否极为重要，因为PCR是一个指数过程，控制反应率的任一参数的微小变化都会显著影响产物的生成量，在这些参数被精确优化与控制后，也还可能出现不同反应管中的产物量的差异，而导致结果的偏差。0 设置内参照是理想的定量方法它 ...

不同浓度竟争模板和控制混合液的配制────────────────EP管号 竟争模板gGM浓度 用量(ng/μl)────────────────1 10.0 10μl2 1.0 10μl3 0.8 10μl4

原位PCR的反转录 原位PCR的反转录不同于原位PCR的过程包括两个：即蛋白酶消化后用无RNA酶的DNA酶消化过夜和原位PCR的反转录过程。此处主要介绍这两个过程，其余方法同原位PCR。1．DNA酶消化【试剂与配制】无RNA酶的DNA酶10×缓冲液：35μl 3mol/L NaAc，5μl 1mol/L MgSO4，60μl DEPC水【操作方法】（1）在蛋白酶处理过的玻片上加入1μl ...

竞争PCR作mRNA定量 此种技术的策略是用一种竞争模板与靶序列cDNA同时扩增，使用同样的引物经过PCR扩增之后，能将这些靶cDNA区别开来。竞争模板是一种突变的靶cDNA，它的突变位点为一个新的限制性内切酶位点，这种突变体能够很容易地用PCR定点诱变来得到。也有利用基因组质粒DNA作为竞争模板，在紧靠一小段(10～200bp)内含子序列的两个外显子上选择寡核苷酸引物，按照靶cD ...

直接原位PCR（In situ PCR） 原位PCR是原位杂交细胞定位和PCR的高灵敏度相结合的技术，使得靶基因检测有了极大的改进。此技术是在细胞（爬片、甩片或涂片）或组织（石蜡、冰冻切片）上直接对靶基因片段进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。1． 组织切片和细胞样品的制备【试剂与配置】10%福尔马林二甲苯PBS【操作方法】（1）用10%福尔马林固定组织8 ...

用PCR检测白血病时T细胞受体β链基因重排【操作方法】 （1） 引物设计：已知基因重排分二步进行其结果为：①D/J重排:Dβ1和Jβ6 Jβ7之间重排产生D―N―J融合片段N为随机寡核苷酸；②V/D重排:Vβ和Dβ1―N―Jβ6―Jβ7之间再重排，产生V―N’―D―N―J重排片段。对于D/J重排引物设计于Dβ1和Jβ2互补片段，对于V/D重排则设计一条与Vβ片段互补，另一条与Jβ2片段互 ...

PCR在淋巴细胞抗原受体研究中的应用 T细胞识别各种抗原，是依靠细胞表面的T细胞受体复合物(TCR)。TCR是由4条多肽链(α.β.γ.δ)组成，每条链由相应的基因编码，其基因是由高变区(V)，多样区(D)，连接区(J)和恒定区(C)组成。由于不同的V―D―J重排，使PCR产生多样性和特异性。经PCR扩增可以检测细胞单克隆基因重排，同样，免疫球蛋白(Ig)重链基因重排是产生抗体多样性和特 ...

应用PCR扩增T细胞受体基因重排【操作方法】 （1） 引物设计：引物1～11是用于PCR的引物其目的是扩增目的基因和分离特异性探针分别适用于Vδ1-D1-Jδ1重排和Vδ2-Dδ3重排的检测。见表。引物4中用G#取代野生型A产生限制性内切酶Fok1位点。 表 扩增TCR基因重排PCR引物────────────────(1) 5’-GTGTGTATTTGTGGCCTTCA-3’(2 ...

间接原位PCR（原位杂交PCR）与直接原位PCR所不同的是，靶基因在扩增时不进行标记基团的掺入，而是标记一段与扩增片段互补的探针，在扩增结束后，应用此探针进行原位杂交。因此，此处主要介绍原位杂交，其余方法同原位PCR。1．预杂交【试剂与配制】2×SSC50%去离子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v）预杂交液：2×SSC，5%硫酸葡聚糖，50%甲酰胺，0.2%脱脂奶粉【操作方法】（1）在进行完原位P ...

应用锚定PCR技术对TCRδ链进行分析【操作方法】（1） 提取外周血淋巴细胞总RNA；（2） 利用oligo-dT或特异的C区序列作引物在逆转录酶作用下合成第一条cDNA链；（3） 于cDNA 3’末端添加Poly(dG)尾反应液(含2mmol/L CoCl21 mmol/L dGTP)和脱氧核酸末端转移酶(TdT)，37℃×1h;70℃终止反应，用乙醇沉淀DNA；（4） PCR扩增：基因5’端 ...

PCR扩增免疫球蛋白重链的CDR3基因 在B细胞发育过程中V―D―J的重排可导致某些核苷酸的随机缺失或插入。因此不同的B细胞克隆经PCR后产生的扩增片段长短不一。正常的多克隆淋巴细胞群的扩增片段含有不同长度的片段电泳检查时呈现出所谓的“片状”结构而单克隆的B淋巴细胞白血病标本经PCR扩增后产生一明显的同一长度的扩增片段电泳时呈现出紧密折带状结构。这就是应用PCR快速检测单克隆性的残留白 ...

免疫细胞的分离 免疫细胞是泛指所有参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞及其前身，包括造血干细胞、淋巴细胞、单核巨噬细胞及其它抗原提呈细胞、粒细胞、红细胞、肥大细胞等。 各种免疫细胞的分离、纯化及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。免疫细胞的检测即是用体外试验对机体各种参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞进行分离、纯化鉴定、计数和功能测定籍以了解机体的免疫状态并 ...

外周血白细胞的分离1．自然沉降法　 人外周血红细胞与白细胞的比例约为6000～1000:1，两类细胞的沉降速度不同，据此加以分离。自然沉降法是利用红细胞自然沉降率较快加以分离。该法简便易行，对细胞损伤少，但纯度差。【试剂及配制】（1） 无Ca2+、Mg2+ Hank’s液（2） 含10%～20% 灭活小牛血清Hank’s液【操作方法】（1） 取静脉血2ml，放入加 ...

基于细胞表面标记的免疫细胞分离方法1、补体细胞毒分离法 采用特异性抗细胞表面标记的抗体，结合具有该表面标记的细胞，在补体的作用下，使具有该表面标记的细胞发生溶解，将其从混合细胞群体中去除。2、免疫磁珠分离法磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁场的吸引作用， ...

基于细胞物理性状的免疫细胞分离方法1、根据各种细胞比重的差异（1）自然沉降法（2）密度梯度离心法 ①Ficoll-Hypaque密度梯度离心法：人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cellPBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细胞和单个核细胞比重为1.075左右。利用 ...

白细胞的纯化1．低渗处理法【试剂及配制】（1）蒸馏水（2）1.8%氯化钠溶液【操作方法】（1） 上述各种方法所得白细胞悬液中加入1ml蒸馏水，轻轻地震荡20s，使混杂的红细胞裂解；（2） 加等量1.8%氯化钠溶液，调至等渗；（3） 再加Hank’s溶液混匀，离心沉淀，反复两次;（4） 取末次沉降细胞配成所需浓度的白细胞悬液。2.氯化铵处理法【试剂及配制】（1） ...

聚乙烯吡咯酮包被的硅胶混悬液分离法分离外周血单个核细胞【试剂及配制】（1） 1.5mol/L 10×PBS：称取10g NaCl，2.5g KCl，14.4g Na2HPO4，2.5g KH2PO4， 先用少量蒸馏水溶解上述各物，再用蒸馏水定溶至1000ml。 （1） 1×PBS：将上述10×PBS用蒸馏水稀释10倍即成。（2） ...