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PCR常用优化策略PCR过程中如果没有找到最佳的扩增条件将会导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；而在另一个极端，又可能没有扩增到任何产物。这时改变已知对引物－模板的忠实性和引物延伸有影响的诸多参数中的一两个，将会达到优化扩增的目的。其中最主要的优化变量包括 Mg2＋浓度、缓冲液pH值和循环条件，在循环条件中又以退火温度最为重要。1．降落PCR降落PCR代表了一种完全不同的PCR优化方法，它不是 ...

PCR常见问题总汇(一）PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性 ...

1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异 ...

摘录于某公司技术资料我不是做广告的所以贴在这里：RT-PCR 1. cDNA产量的很低可能的原因：RNA模板质量低对mRNA浓度估计过高反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足同位素磷32过期反应体积过大，不应超过50μl2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系与反应起始时RNA的总量及纯度有关建议在试验中加入对照RNundefined第一链 ...

多重PCR的一些体会这些年一直做一些多重PCR，对多重PCR，有一些自己的小体会，现写出来与大家一道共享并期待与大家的交流。实际求是的说，高通量核酸扩增技术一直是大规模核酸样品检测分析的瓶颈。现在的样品检测比如基于生物芯片平台的核酸样品检测，都是基于同时对成百上千个样品、上百上千个靶基因位点进行，很不幸的是，现有的核酸扩增技术，当然主要是PCR技术，现有的多重PCR是远远不能满足需求的。因此，现在又很多人都在致 ...

由于全血中存在有很多PCR反应抑制物，例如，血红素，蛋白质，盐，抗凝剂等，使得常规的Taq聚合酶不能从全血中直接进行PCR反应。因此，现在临床上往往先要从全血中提取DNA, 但即使这样，也不能完全克服上述抑制物的影响，这也是为什么目前临床上的DNA扩增反应，常常失败的原因如果在遗传病诊断中，能够从全血中快速有效地进行DNA扩增，可以节省大量的人力，时间，费用，对临床遗传病鉴定，以及亲子鉴定是一个革命化的改进。KAPA全 ...

经常看到许多战友因为PCR的非特异扩增而烦恼，不如我们把我们曾经也遇到过这样问题，经过努力后得到了目的条带的成功经验一起分享。首先我先把我的消除非特异扩增的方法先贡献出来，请大家多多批评指正。PCR类型：Long PCR一、PCR体系1、酶：Pyrobest DNA Polymerase2、模板：人类基因组DNA3、引物：根据已知的DNA序列设计的引物。4、目的片段长度：约3.5K（上述四项，我个人认为应当注明，因为许多PCR可 ...

近段时间在“PCR技术讨论板”有不少关于RT-PCR引物设计的求助，所求助的引物有相当部分都是用于检测某一基因的表达的。其实，对于很多基因而言，用于检测其表达的RT-PCR引物已早有文献报道，我们完全可以利用这些已有的资源。我们所需要做的只是找到这些已发表的引物序列，通过Blast验证其是否正确、确定其特异性，用软件分析引物的好坏后直接使用就可以了。下面介绍2种搜索引物序列的方法，希望对大家有用。1. 通过搜索基因来 ...

因为以前只是用Trizol提取过培养细胞的RNA，加入氯仿后只需吹打即可，没有提全血RNA的经验。前几天要提全血拉，我看步骤说明里面，“加氯仿后剧烈震荡”，因为偶力气大，生怕把mRNA弄断了，就来了个不剧烈的震荡。跑完电泳一看，基因组DNA污染；RNA只见18S、28S条带，均模糊、断裂。我以为是Trizol过期了（上海生工产品），一边订新的，一边好奇，把全血改为400ul，把Trizol改为600ul（原来的量分别是2 ...

vehemency:1。模板可能有降解，建议避免反复冻融，放置时间不能太长。2。抽提RNA时有污染，包括基因组DNA污染和蛋白质污染，需重做抽提。3。提高退火温度，减少非特异性扩增。4。减少循环次数，减少非特异性扩增。5。电泳缓冲液时间太长，ph值和盐离子浓度明显改变。6。电泳时电压不能太高，8V/cm。7。一般来讲，基于promega和TaKaRa的PCR反应体系中，Mg和dNTP的浓度是相匹配的，不需改动。sstsst ...

大家好，课题是结肠癌甲基化方面，我想先把DNA ,RNA和蛋白质提取出来保存，以下是我的初步方案，请大家不吝指教,谢谢哦！RNA 抽提1.匀浆处理将组织在液氮中磨碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%2.将匀浆样品在室温（15～30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。3.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。4. 4℃ 1200 ...

关于REAL-TIME引物设计和探针选择， 附有三种常用探针的介绍网址，希望对大家有用1.The design step: the selection of PCR primers and probes2.Choice of detection method (SYBR Green or a fluoresent nucleic acid probe) for the real time PCR.Generally, real time PCR with SYBR green is used to optimize primers and is principa ...

欲通过RT-PCR检测一种基因的不同剪接异构体表达情况，在文献(cancer research, oncogene)中查到的两对引物序列如下：P1 5' atg agg atc cca tgg gcc agc a 3'P2 5' aag ggc ttt tca ctt gtt tta c 3'P1 5' atg agg atc cca tgg gcc agc a 3'P3 5' aag ggc ttt tca cct gta tga g 3'RT用的是MBI的试剂盒,反应体系20ul：总RNA 4.0 ug, oligo 1 ul,M-Mulv 1 ul,反应条件为70℃5分钟,37℃5分钟,42℃60分钟,70℃1 ...

理论上应该扩增出超过2kb的片段，但每次得到的PCR产物都只有700多bp，跟这个基因的cDNA长度类似。换过好几个模板，得到的结果都相同。上游引物：CATGAGCTACATCAATCTGCCC下游引物：AGTCCAACCTGGGTAGGAGGenebank上查到的序列：小鼠胸苷激酶（tk）基因M684891 ccatggcaga tccggaggga tggtcgagct ccaggctttt cacgtagctg agaggt ...

RT-PCR引物序列 基因来源 引 物 序 列 产物大小（kb）β-actin 人 有意义链CCTCG CCTTT GCCGA TCC 反义链GGATC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 0.62 kbβ-actiundefined 大鼠 有意义链TACAA CCTCC TTGCA GCTCC 反义链GGATC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 0.62kbβ-actin 小鼠 有意义链GTCGT ACCAC AGGCA TTGTG ATGG反义链GCAAT GCCTG GGTAC ATGGT GG 0.49 kbGAPDH 人 有意义链 GGTGA AGGTC GGAGT CAACG ...

Real-Time RT-PCRhttp://www.ambion.com/techlib/basics/rtpcr/by Subbu Dharmaraj, MSRT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) is the most sensitive technique for mRNA detection and quantitation currently available. Compared to the two other commonly ...

实验要求为：用实时荧光定量PCR检测损伤前后大鼠某一基因的表达变化，选用Taq man法，从ncbi中查到基因cDNA序列如下：（基因编号：NM_053613）1 atgaagaggg cgtcctccgg aggaagccgg ctgccgacat gggtgttatg gctacaggcc61 tggagggtag caacgccctg ccctggtgcc tgtgtgtgct acaatgagcc caaggtcaca121 acaagccgcc ccca ...

因为之前有个帖子，邮箱中的资源被不良的人删掉了，所以特发此贴。rayfile地址：http://www.rayfile.com/files/098fe2ee-891e-11dd-9cdc-0014221b798a/不会下的可以留下邮箱号我发给你。Publisher: Humana PressNumber Of Pages: 431Publication Date: 2007-08-02ISBN-10 / ASIN: 158829725XISBN-13 / EAN: 9781 ...

请人测了一株菌株的16SRNA序列，给了两段序列。使用Blast 分别检索后，结果不能确定到种，因而想用完整的序列进行检索，由于我不太熟悉序列分析，请朋友帮我看一下这两段能否组成一个完整的序列。1205013.S1.1541RCCTTCGATCGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAATCATCTGTCCCACCTTAGGCGGCTGGCTCCAAAAAGGTTACCCCACCGACTTCGGGT ...

帮朋友发个帖子，他刚进实验室，PCR实践技术还在摸索中，找了以下这些文章来学习，不看不知道，一看吓一跳，这些用Real-PCR做出来的研究好些都发了不错的杂志，影响因子都比较高的，可惜我这边没有权限下载全文，哪位朋友帮帮忙，下载几篇全文吧，本人不胜感激！！！1. 标题: Quantitative analysis of cell-free Epstein-Barr virus DNA in plasma of patients with nasopharyngeal car ...