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        [交流]PCR中出现非特异扩增

        丁香园论坛

        11731

        经常看到许多战友因为PCR的非特异扩增而烦恼,不如我们把我们曾经也遇到过这样问题,经过努力后得到了目的条带的成功经验一起分享。

        首先我先把我的消除非特异扩增的方法先贡献出来,请大家多多批评指正。

        PCR类型:Long PCR

        一、PCR体系

        1、酶:Pyrobest DNA Polymerase

        2、模板:人类基因组DNA

        3、引物:根据已知的DNA序列设计的引物。

        4、目的片段长度:约3.5K

        (上述四项,我个人认为应当注明,因为许多PCR可能因为这四项不同而导致PCR循环和体系调整有较大的差异,同时希望各位战友在讲自己的经验时也指出,若觉得还有其他要讲明的请也指出。)

        5、体系的各成分的终浓度,主要依据我选用酶的厂家所给的标准体系,并参考《分子克隆》中普通的PCR体系。

        二、PCR循环

        根据厂家提供的标准PCR循环,并参照《分子克隆》结合自己的模板和引物的各项值来设计。

        通常我先做梯度PCR,来摸索最佳退火温度。温度设定范围:两条引物的高Tm值+3度和低Tm值-5度之间。

        我认为最佳的梯度PCR电泳结果应该是

        1、所有的温度只出现一条带;

        2、低温出现多条非特异性带,随着温度升高条带逐渐减少,到某一较高的温度所有条带均不出现,或者仅出现单一条带。

        结果分析

        1、若单一条带为目的条带,万事大吉。若非目的条带,我通常的做法比较极端,就是换引物。

        2、若非特异性扩增中无目的条带出现,我的极端做法:换引物。

        若非特异性扩增中出现目的条带,可分为以下情况。

        a、目的条带的亮度在所有的温度中都比非特异性条带弱,则做如下优化:减少Mg离子的含量、减少dNTP的含量、采用热启动、加入PCR辅助剂DMSO等、切胶回收。(我个人的经验,这些优化通常很难再获得单一的目的条带,我通常如果优化两次不成功,就直接换引物了。)

        b、目的条带的亮度在所有的温度中都比非特异条带亮,但即便到了最高温度也没有消除非异性扩增,则做如下优化:做Touch down PCR,通常我认为Touch down解决这一问题成功率比较高。

        c、非特异扩增的非目的条带随温度升高而消失,特异性条带仍旧存在。则选用能获得最佳产量和特异性目的条带的退火温度即可。

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