DXY review--PCR拖尾问题

vehemency:

1模板可能有降解，建议避免反复冻融，放置时间不能太长。

2抽提RNA时有污染，包括基因组DNA污染和蛋白质污染，需重做抽提。

3提高退火温度，减少非特异性扩增。

4减少循环次数，减少非特异性扩增。

5电泳缓冲液时间太长，ph值和盐离子浓度明显改变。

6电泳时电压不能太高，8V/cm。

7一般来讲，基于promega和TaKaRa的PCR反应体系中，Mg和dNTP的浓度是相匹配的，不需改动。

sstsstsst1 :

原因往往由于酶的量过大或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶的量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓 度。④增加模板量，减少循环次数。

l9869

1模板混有基因组DNA

2模板中混有蛋白或加入的Taq酶过多

3非特异反映

4电泳液用久了不换，电泳胶脏了

丁香苹果 :

一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。

hlxm :

我认为有两种可能：

1、引物设计的不好，非特异，这种情况容易出现非特异扩增造成有非特异性扩增带或拖尾现象。

2、扩增的条件不合适，一般退火温度低时容易使引物在非特异位置结合引发扩增反应造成拖尾。

针对以上情况，我想你可以先提高退火温度试试，如果实在不行，你再看看你的引物是不是合适，如果

activation:

PCR 拖尾的可能原因很多。

如果内参可以扩出来，只能说明程序可能是适合的，但不能完全说明体系合适。体系内的各组分，如模板、dNTP、Mg离子、引物等都可能造成拖尾。你先得考虑换了那种成分后出现了拖尾，逐项试验。引物当然是最重要的因素，但绝非造成拖尾的唯一原因。

而且，一般而言，拖尾不会是引物的问题，尤其是已经被用过证明能扩出特异片段的 引物，更不可能是它的问题了。

flyingrisker :

你先不要加Taq酶，等到其他东西都加完了以后，放到PCR仪上去，到那时再加，马上开启PCR程序试试。

我不知道你的反应体系是多少体积的，你检查一下你的dNTP的量够不够。

适当减少2～3个循环试试，可能会有效果。

wingsofdreams :

告诉你一个去除引物二聚体的诀窍

取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的
我前几天刚开始做分子生物学实验，也是从别人那里讨来的经验.我试过我用的别人的内参也只有引物二聚体，当我上述处理后，目的条带相当的亮。

我想楼上 的或许也是这种情况，不妨一试阿

neighboour

我的分析如下：

（1)首先排除你的cDNA模板有无问题

（2)其次，PCR反应中的能存在的情况：A.引物的工作浓度是否在0.1－0.5pM之间，超过1PM浓度在30个CYCLE的反应中易于出现PRIMER-DIMER.B.用相应的软件检查引物设计有否缺陷；

C.你引物的TM值和你褪火温度是否相匹配，记住Mg浓度和褪火温度之间有关系；D.加PCR反应体系时，最后教Taq，并且在冰上操作，PCR反应后产物最好不要在室温下放置太长时间。

总之，这种情况在新手经常遇到，先减少引物浓度，并且拿别人的CDNA检测一遍，基本可以解决。如果是引物本身的硬伤，用可以试一试一些方法去解除自身的二级结构（DMSO,glycerin、BSA)。从长远来考虑，重订还是经济合算的。