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llh刘丽华 请教高手我最近做western blot，结果总是不理想，目的条带总是很淡，上样量已经是60ug了，封闭用的是5%脱脂奶粉，我还应该怎么改进哦？下面是我的结果，采用的是ECL化学发光，凝胶成像系统拍照，下面一条是我的目的条带。 麻烦各位帮帮忙吧！Mostino 转膜应充分，并提高第一抗体的使用量！成其瑞 用好点的抗体volano 我觉得你首先应拿一个别人已经做过western blot证实条带条件好的蛋白样本来做对比，排除你 ...

tianlicaas 各位高手：本人想在蓝藻中做一个看家基因的定点突变（Site-Directed Mutagenesis），也就是说，用体外合成的点突变后的看家基因替换基因组上的原始基因，在这里请教大家了！爱在进行时 找到的资料实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不 ...

habaside543120 钾后面的加号是一个上标，，，和HEPES写在一起，，不知道这个东西怎么配也？？有人可以指点一下吗？？habaside543120 studypeople hepes做PH缓冲剂，浓度是10mmol，最后调PH的时候，用KOH调，应该就行了本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号：shixiongcoming

能nca 我反转录的cDNA，跑了电泳，发现条带是一抹的，但是有三处看着比较明显的条带，我问了别人都说，cDNA的条带都应还是一抹的，没有特别明显的条带，我不知道自己的cDNA除了什么问题，有的人和我说是由污染，到底是怎么回事啊，有出现类似情况的师兄师姐们，帮忙解答一下原因出在哪里啊？nono1986 对总mRNA进行逆转录得到的cDNA是涂抹带的，那三条明显的条带应该是rRNA。能nca 哦，谢谢啊能nca 对了我还想问一下， ...

walterxp 各位前辈，我想请问一下pet32a用什么受体菌做表达比较好，我只有DH5α。谢谢花生剥了壳 可以用Rosetta或者BL21，表达的都挺好。walterxp 好的谢谢 我用BL21了guoda11 BL21，我看行！用pET32a作为表达载体，我们实验室很多真核蛋白都实现了可溶性表达！本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号：shixion ...

angel880627 最近因课题需要，要构建基因沉默的小鼠模型来进行试验，有木有大侠知道得到慢病毒载体后该如何构建小鼠模型？文献里写的都很模糊，实验室里有没有师兄师姐做过，还望有经验的大虾能给点指导，越具体约好啊~~~majilee 你说得也很模糊1.是要小鼠体细胞都沉默的话 需要从es细胞开始2.另外一种是中国人很常见很经常做的 慢病毒包装好后注射老鼠angel880627 从ES细胞做起是要怎么做？我看到有的文献在构建的时 ...

能nca 实验室的DEPC水，处理了一年多了，是以前师姐装在EP管得，实验一直就用这个做实验，这个水这么久了还能用吗还有70%的乙醇也是用这水配制的，也放了一年多了还能用吗？devil19840 只要保存得当，容器干净、没有别的东西污染，应该就没问题volano 俺待过的实验室，DEPC处理过的水，4度只保留一周。 勤配，少量配，尽量用新鲜的，不然到时候RNA作不出来，找原因还得排除一条DEPC水有没有过期呀？何必呢，平时多勤快点， ...

黑洞里的鱼 请教一下，启动子区（-5kb~0kb)指的是mRNA的5'端上游5kb内，还是对应的DNA的sence strand的5'端（即编码mRNA的DNA链对应的那条链）？如果是miRNA，假设pre-miRNA上游即（-5kb~0kb)区域是他的启动子区，那这个区域是pre-miRNA的5'端的（-5kb~0kb)吗？还是转录pre-miRNA对应的DNA的5'端？在miRbase查到hsa-mir-140的pre-miRNA ...

毛毛虫0118 我想用人血标本做WB，请问血标本最多可以放多久啊？还有做WB的话，要收集大概多少毫升血就可以了呢？毛毛虫0118 为什么没有人回复我啊？volano 建议你还是自己摸索一个量首先，不知道你要做的目的蛋白是什么？分子量有多大？是不是容易降解？如果分子量大，不容易降解，那可以储存比较长时间，如果你的目的蛋白是小蛋白那就是越新鲜越好吧，我看过师姐做的12KD蛋白，样本稍微放长些时间就悲催了其次，western blo ...

小猪爬墙 如果我要寻找转录因子的下游因子怎么做，比如我发现基因A表达下调了可以导致TGF通路表达下调，想研究其中的机制，具体我该怎么做呢，导师天天催，我都急死了，盼您赐教啊。小猪爬墙 http://www.bioon.com.cn/doc/showarticle.asp?newsid=26539小猪爬墙 http://www.doc88.com/p-47430825856.html本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯 ...

liliuri1231 本人课题需要检测Caspase3的蛋白及mRNA的表达量，众所周知，Caspase3的蛋白有前体（31KD）和激活体（17KD和12KD）之分，但是mRNA也有这种区别吗，如果有的话，我得qPCR的引物应该怎么设计，请大虾指教。shejun1000 liliuri1231 wrote:本人课题需要检测Caspase3的蛋白及mRNA的表达量，众所周知，Caspase3的蛋白有前体（31KD）和激活体（ ...

soarmlxq 有个同学问我，DNA为什么是双螺旋的？它靠什么来形成双螺旋？我告诉他书上说是碱基堆积力。可是这么回答总觉得不够具体。碱基堆积力究竟是怎样的一种力呢？简单的碱基堆积力就能形成双螺旋结构吗？而且脱氧核苷酸本身也不是平面的，它立体的分子构造是不是也对它形成双螺旋结构有帮助呢？另外，如果存在满足以上条件的其他分子双链是否也会形成双螺旋结构？请各位高人帮忙给我一个更确切的答案！谢谢！nono1986 为什么是 ...

g_qhzhang 哪位大侠能够告诉我用荧光染色剂fluo-3/AM测量细胞内钙离子浓度应注意什么？谢过了先g_qhzhang 之前看到园子里有战友讨论荧光染色剂fura-2觉得非常好，对这方面了解很少，被热心战友推荐用fluo-3/AM，不知两个有何区别，只知是2代和3代，希望得到各位大侠指点。婷子 fura2 做流式细胞仪检测fluo3AM 做激光共聚焦好点，但网上看到也有用于流式细胞仪检测的。我之后也要做这个，只是还没找到fl ...

郑哲 我要做miRNA的干扰实验，体外注射mimics，然后看它对靶基因的影响，想知道实验要具体怎么设计呢，要怎么做对照，而且不明白什么是阴性对照，希望大家帮助predator 不知道你的mimics的注射对象是什么，是细胞，还是动物？公司合成mimics时会有阴性对照，可以咨询公司。tntztyx 关注中～～～本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号：s ...

橙子童鞋 希望园子里做过DNA提取的战友们积极回帖啊，比如说一些提取过程容易出错的地方，需要特别注意的地方，很难搞定的步骤等。因为下个礼拜要做这个，头一次，希望大家讨论一下我做的时候可以借鉴。谢谢啦！lairena 你提的是什么的DNA，打算用什么方法啊？是自己配置的试剂还是商品化的提取试剂？duguke2004 去蛋白质，蛋疼的步骤！呵呵qingdaomdbio DEPC很重要啊，要选质量好的，其他的试剂耗材也要选用质量好的， ...

江janice 求助：用的是天根 的胶回收试剂盒，11管PCR产物，差不多500微升的总体积，上四个孔电泳，电泳后用天根的盒子回收到四个EP管，每管40微升，取5微升电泳，居然没有成功，又取10微升电泳还是没有任何条带，不知道可否有人用天根的盒子，是否遇到这方面的问题，一般100微升的PCR产物，回收到多少体积比较恰当，纠结啊，回收了好几次电泳都没有目的条带，盒子是刚买的新盒子，谢谢好心人帮助大鹏鸟 天根的盒子还是很好用的，注 ...

紫贝壳li 课题研究外源分泌蛋白与宿主细胞的相互作用，现有一分泌蛋白能粘附于Hela细胞膜，引起后续一系列反应，但作用位点未知，且该蛋白作用于细胞膜，但未被吞噬进胞内，求怎样检测该蛋白粘附于膜的量大鹏鸟 定性可以用免疫荧光，定量也可以大概的用免疫荧光看看。smartchow 定性用免疫荧光做，具体方法：1、做Hela细胞的细胞爬片2、用5%BSA的PBS溶液去封闭，3、用你的外源分泌蛋白与之结合（外源分泌蛋白溶于PBS中，具 ...

又忘了了 我们实验用miRNA转染后，下调了目的基因，但是转入miRNA inhibitor后，目的基因水平也是下调的，并且下调水平和miRNA相近，这个是什么原因造成的？难道是inhibitor凑巧也抑制了别的基因了吗？或是别的原因，请大哥大姐们帮帮忙啊，谢谢啦！又忘了了 自己顶一下，呵呵大鹏鸟 你的细胞转染效率如何？转染miRNA后干扰效率如何？如果转染效率低的话干扰效果，miRNA的inhibitor的封闭效果都不会好。 ...

elainesummer 请问 鉴别某种细胞中有某个基因表达 是做PCR 还是做RT-PCR？elainesummer 为什么两篇文章一个用PCR 一个用RT-PCR 到底应该是哪个？还是两个都对？elainesummer 第一篇elainesummer 第二篇elainesummer 有人知道吗？elainesummer 顶啊！elainesummer 没人回答吗？nono1986 RT-PCR!elainesummer 人气好弱啊！本文由丁香园论坛提供，想了解 ...

jerome520 我现在急做一批样本的microRNA检测（只检测一个指标），用茎环法，想要送去公司做。康成生物高手们有听说过吗？还有其他代做的公司推荐吗？谢谢！！！zaoyii 我知道广州伯信生物技术有限公司可以做，技术上也比较成熟，这是网站http://www.biosensechina.com/，你可以去看看或者打电话去问问：020-28069086jerome520 zaoyii wrote:我知道广州伯信生物技术有限公司可 ...