重组腺病毒构建、扩增及纯化

（细菌内同源重组AdEasy System）

一、目的基因的克隆（以pshuttle-CMV质粒为例）步骤

1、选择适当酶切位点，进行酶切连接，将目的片段插入pshuttl-CMV质粒多克隆位点。

2、重组质粒鉴定： 酶切鉴定或测序。

3、重组质粒扩增，纯化并准备适量含目的基因的穿梭质粒。

4、用PmeI单酶切线性化重组穿梭质粒，电泳鉴定质粒完全被切开。

5、胶回收线性化质粒，以备共转化使用。

二、共转化

1、大肠杆菌BJ5183电转感受态制备

（1）从新鲜琼脂板上挑取单个BJ5183细菌，接种于LB培养基中，37℃振摇过夜。

（2）接种25ml过夜培养物于500ml LB培养基，37℃振摇，至OD600 达到0.4.

（3）迅速将培养物置于冰浴中30min，至充分冷却。

（4）将菌液转移至预冷的离心管中，4℃下以2500r/min离心15 min，弃培养液，回收细胞。

（5）以10ml预冷的10%甘油洗涤沉淀，低温离心，共两次。

（6）加约1ml（适量）预冷的10%甘油重悬沉淀，稀释悬液100倍，测量OD600,至稀释浓度为2-3×10¹⁰个细胞/ ml （1.0 OD600约2.5×10¹⁰个细胞/ml）。分装，-80℃或液氮保存待用。

2、病毒骨架质粒转化大肠杆菌，扩增，纯化。

3、将1-5ul （约1ug） 线性化的穿梭质粒及1ul（约100ng/ul）病毒骨架质粒（如pAdEasy-1）加入至含约40ul BJ5183电转感受态的EP管中混匀，冰上冷却。

4、将混合物加入电转杯，电击（1250-1500V/mm,5ms）。

5、电击结束取出样品，加入1ml SOC或LB培养液，37℃低速振荡40min。

6、取适当体积的电击转化细胞液涂于数个卡那霉素抗性平板（25-50mg/ml），37℃培养16-20hr.

7、次日挑取平板上长出的菌落（选择最小的菌落），接种于3ml含25-50mg/ml的LB培养基，37℃培养10-15hr。

8、碱裂法提取质粒，0.8%琼脂糖凝胶电泳筛选，大质粒为可能阳性克隆，进一步酶切鉴定。以PacI单酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳如显示出一条大片段（约30kb），及一条小片段（约3.0或4.5kb）（同时可进行其它酶切鉴定），则基本确定为阳性克隆。

9、取1-5ul 阳性质粒转化至DH5α大肠杆菌细胞（BJ5183为recA+，质粒DNA易发生突变，DH5α或JM109，XL1-blue菌株为重组缺陷性菌株，可稳定扩增已鉴定的重组质粒），扩增细菌并纯化质粒。

三、重组病毒质粒转导293细胞

1、293细胞培养：转导24小时前，以方瓶为例，接种2×10⁶  293细胞于25cm²方瓶，使生长密度约50-70%.（也可以使用6孔或96孔板）

2、以PacI单酶切重组病毒质粒（转导25cm²方瓶约需4ugDNA），完全线性化后，乙醇沉淀，再以20 ul ddH₂O溶解。

3、脂质体包裹质粒（以Lipofectamine为例）：每4ug PacI约需20?l Lipofectamine包裹。质粒及脂质体分别稀释于500ul无血清培养基再混合，置于室温下15-30min。

4、以无血清培养基轻轻洗涤培养瓶，另加2.5ml无血清培养基，37℃放置10min。

5、将Lipofectamine-DNA混合物加入培养瓶，37℃孵箱放置4hr。

6、4hr后，弃Lipofectamine-DNA混合液，另加入6ml DMEM完全培养基（含10% FCS）。如有大量细胞漂浮，可不弃Lipofectamine-DNA液，加入6ml DMEM完全培养基，37℃孵育过夜，再换液。

7、培养过程中观察细胞生长情况。约2周后可观察到细胞病变（CPE）出现（如用pAdTrack-CMV质粒，由于含GFP,可观察到绿色荧光）。

四、重组病毒鉴定

1、转导10-14d后，收集细胞沉淀，加入2ml灭菌的PBS混悬，冻融细胞，离心后收集上清保存于-80℃。

2、取30-50% 步骤1中上清，感染50-70%饱和度的25cm2方瓶中293细胞。2-3d后出现明显细胞病变。

3、感染后3-5d，当1/3-1/2细胞漂浮时收集病毒。按步骤1收集细胞并准备病毒上清。通过Western blot和/或PCR鉴定重组腺病毒产生。

4、PCR鉴定重组病毒。取5μl病毒上清加入10μl蛋白酶K，55℃孵育1hr,再煮沸5min，离心后取1-2μl作PCR。

五、重组病毒扩增，纯化

1、75cm²方瓶中接种293细胞，至密度达到90%,加入适量病毒上清感染细胞。3-4d后，细胞几乎变圆，且有一半细胞漂浮，则收集所有细胞。约500g转速离心，弃上清。

2、以灭菌PBS重悬沉淀，反复冻融4次。4℃下7000g离心5min.病毒纯化至少需要30瓶75cm2方瓶细胞。

3、CsCl连续梯度离心纯化：50ml离心管中称量4.4g CsCl,加入8ml病毒裂解上清液，混匀，体积约为10ml.转移至12ml超速离心管（用于SW41转头）中，覆盖约2ml矿物油。平衡后，10℃下32000 rpm离心18-24hr,用注射器抽吸离心出的病毒带。

（也可CsCl不连续梯度离心：20ml超速离心管中缓慢加入8ml CsCl 1.4 （53 g + 87 mL 10 mM Tris-HCl,pH=7.9），上面小心加入6 mL CsCl 1.2 （26.8 g + 92 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9），再小心加入病毒上清液至体积达到20ml。平衡后，4℃下 23000rpm离心90min （SW28转头），用注射器抽吸下层蓝白色病毒带）

4、病毒透析去盐：配置透析液（10 mM Tris pH 8.0，2 mM MgCl₂，5% sucrose），灭菌处理。4℃透析，更换3次透析液，可基本去除CsCl，病毒保存于-80℃。

六、病毒滴度测定（TCID50）

1 、细胞准备：96孔板中接种100μl 293细胞，每孔细胞数约10⁴个，以2% DMEM培养

2、稀释病毒液准备：以2% DMEM将病毒液稀释成8个较高浓度（如10^-3-10^-10），每个浓度重复10个，每孔加入病毒稀释液100μl。另留两排不加病毒液作为阴性对照。37℃下，孵箱培养10天。

3、10d后观察细胞，记数每排出现CPE的孔数，计算细胞病变率。（如某一浓度各孔细胞全部病变，比率为1,如无细胞病变，则比率为0）。

4、计算T =10×10^{1 + d (S - 0.5)} /ml

d = Log 10 稀释度（如为10倍稀释℃，d=1）

S = 各浓℃细胞病变比率之和

实验室重组腺病毒常用质粒：病毒骨架质粒：pAdEasy-1, pAdEasy-2

穿梭质粒：p-Shuttle, p-Shuttle-CMV, pAdTrack, pAdTrack-CMV