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基本方案运用 AdEasy 方法产生重组腺病毒载体

相关实验：腺病毒载体实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	感兴趣的基因
试剂、试剂盒	电促感受态 BJ5183 细胞限制性内切核酸酶苯酚氯仿异戊醇 HBSS 或灭菌的 PBS 乙醇感受态 DH10B 细胞具有卡那霉素抗性的 LB 培养基穿梭载体 DNA 乙酸铵
仪器、耗材	脂质转染 AMINE 试剂铺有卡那霉素抗性的 LB 固体培养基皿 Opti-MEM I 培养基琼脂糖凝胶锥形管

步骤

1•挑取可能含有感兴趣基因的候选克隆，接种于 2m l具卡那霉素抗性的液体培养基内，由 15m l锥形管装载。置于 37°C定轨摇床上扩大培养过夜。 2•使用任意标准的碱裂解法提取纯化质粒DNA。通过限制性内切核酸酶酶切分析和 (或）PC R 扩增证实转基因的存在和方向。除 pAdEasy-1和-2是氨苄青霉素抗性以外，其余所有的穿梭载体和重组腺病毒质粒都为卡那霉素抗性。 3•利用Pme I 或 Ecoi? 工限制酶酶切，线性化已证实的穿梭载体。为保证完全酶切，建立 100^1 (0. 1〜0. 5^g DNA) 反应体系并加入5|u l的酶，以使本底降至最小化并经琼脂糖凝胶证实是否酶切完全。 4•往100^1酶切反应后的体系中，加人 IOOjlJ 双蒸水， IOOjlJ 7.5m〇 V L 乙酸铵以及2pl seeDNA (或以 2^1 20mg/ml 糖原代替）。再加人 3(%1 25 : 24 : I (V/V/V ) 苯酚/ 氯仿/异戊醇， PH8.0 (附录 3B)，提取DNA。 5•转移DNA溶液上层至一干净离心管内。再加入 GOOjbJ 1〇〇%乙醇， 16 〇〇〇 g■，室温，离心 5min。再加入7 0 % 乙醇清洗沉淀两次以消除残留的盐。 M 双蒸水重悬D N A 。’ 6 . 准备电促感受态BJ5183细胞，等分成20^1/管，保存于一80°C (支持方案3)。准备转化时，将其解冻并置于冰上。 7. 往2〇4的感受态细胞内加入8.OjuI 的经PW I 酶切后的穿梭载体（来自第5 步）以及 1. 0/』的 pAdEasy-1超螺旋腺病毒骨架载体（ loong/y )。最终体积限于< 3〇 iLj 。 8 . 小心转移细菌/D N A 的混合物至冰冷的2m m 电转杯内，避免产生气泡。并保持电转杯置于冰水中。将 Bio-R ad 基因脉冲电转仪调至2500V , 20〇 n ， 25jliFD，并递呈脉冲。 9•将转化的混合物重悬于5(%1 L B 培养基中。铺于 3 或 4 个 LB/卡那皿， 37° C 培养过夜。在铺jni前，转化的细跑可先于37°C静止培育10〜20min。 10.挑取 10〜20 个最小的单克隆，接种于2m l含 25^g/m l卡那霉素的液体培养基内，置 37°C摇床上扩大培养1〇〜I 5h。

行闘触雛麵酬分能赃它们 _ 始结构最后 ^ 氯化铯结合法或，用商业提纯质粒的试剂盒提纯质粒，以备转染293细胞。 I 如，本底过_，可考細下的料方法。 Q 在电转后，^必再培育细菌的混合物，而是直接铺 ② 尝试减少用酶切消化的穿梭质粒〇 ^^八量•③尽^ 使穿梭质粒产生缺口的可能性降至最低（如使用碱裂解法制备提取穿梭质粒）。、由于在BJ5183 细胞内，廣粒发生重组和重排的频率较高，故实验者就不应再使用BJ5183细胞来培养候选的重组克隆，而应从Bj5183细胞内尽早地回收潜在的重组，粒，且-旦确证，则应再将质粒转化至D H 1〇 B 或其他普通的菌株内，以供质粒复制。 14.转染之前12〜20h ，将 293细胞以2X IO6个细胞/瓶的密度铺于i 个或 2 个 25cm2 组织培养瓶中。（在转染之时，细胞融合度应达到5〇%〜7〇%)。 15•转染当天，用 P ac I 酶切消化重组腺病毒质粒（大约4网 D p w 瓶）。建立 i 酶切反应体系以确保酶切完全。用乙醇离心沉淀酶切消化后的质粒，加入 2 〇菌水重悬质粒。 16•根据制造商的手册，进行标准脂质体转染。将知 § 经户沉工酶切消化的质粒和2〇 [ 脂质转染A M I N E 试剂混合加入至已装有500jbj 〇pti_M E M I 培养基的 2 5 ^ 组 & 培养瓶中。将D N A /脂质转染A M I N E 试剂混合液室温静置I5〜3〇min 17. 当混合液静置之时，去除铺有293细胞的25cm2 组织培养瓶内的培养基轻轻加人 4m l 无血清培养基（如纯 D M E M 或 H B S S 培养基）以洗除残留的含血清基。然后再去除D M E M ，住母瓶25cm2组织； 1 ¾•养瓶内加入2.5ml Opti-MEM T ±立兼甚放回 37。 (：， 5% C 0 2 培养箱约l〇min。〇养基。在清洗 2 9 3细胞时需特别谨慎，因为2 9 3细胞与瓶壁的黏附力往往较低 18. 往 25cm2组织培养瓶内逐滴加入D N A /脂质转染A M I N E 试剂混合 = 户苒放回培养箱内。， J 口丹職 19. 4〜6h 后，去除含有D N A /脂质转染A M I N E 试剂混合液的培养基，妖；^加人 7 1 新鲜的完整D M E M 。如果发现大量的悬浮细胞，则不要更换含有D N A /脂质转染A M i n e 试剂混合液的培养基，而是往瓶内加入6.〇1!11的完整〇]^£]^，再放回培养箱培养 1〇〜 12^ 。然后去除培养基，再向每瓶内加入7m l 新鲜的培养基。 2 0 . 如果使用的是pAdTrack-based载体，则可通过G F P 的表达，利用荧光显微镜监测转染效率和病毒产物。已转染的细胞应置培养箱内持续培养1〇〜12d。这二

无需更换培养基。命 # / 又 ^ 说，直到转染后两个星期，显微镜下都应观测不到明显的噬斑和细胞病二 ^ ，，， 1 染后 5〜 7d ，熒光显微镜下通常可观察到 ⑶ ^ 斑。而是否观察 T , 3 = 4 斑，依赖于转染效率。低转染率（1 0 % 〜 3 0 % ) 可能产生彗星样 ” 然而高转染率（ > 5 Q % ) 可能产生 “散射星状 ” 现象。 . 离心管内。，用细胞刮（不能使用胰酶消化）刮下细胞，并转移至5〇m丨锥形、如果转染效率较低（ < 30% ) ，更偏向于在转染15d后收获细胞，以保证理想的初始病毒滴度。这种情况下，在转染10d后应加入 2ml新鲜培养基继续培细胞。 22. 500心代离心细胞 I0min，然后再用& 〇 miH B SS或灭菌P B S重悬细胞。 23•干冰/甲醇浴冷冻细胞， 3r c 水浴解冻以从细胞释放病毒。剧烈地旋转。再重复冷冻/解冻/旋转 3 个循环。一旦解冻则迅速从水浴中移出管子以避免加温的病毒浮于上层，否则会降低滴定率。 24. 500心 4°C短暂离心样品，使细胞碎片形成球形。如果不立即用于感染，一2〇。〇或一80°C保存病毒溶胞产物。备选方案用 A dE asier细胞生产重组腺病毒质粒在 Stmtagene公司可购买到多能AdEasier细胞（称为 BJ5183-AEKL)。这对于只进行少量腺病毒构造来说尤其方便。附加材料（基本方案；标7 的条目参见附录1) pAdEasier-2 质粒（ Quantum Biotechnologies 或 Stratagene 的都可以） V L B 琼脂糖板含50jug/m l氨节青霉素、 30jug/m l链霉素限制性内切核酸酶CHhd n 或工） V L B 培养基，不含抗性 V L B 培养基，含25哗/〇11卡那霉素 1. 转化 50hg pAdEasy-1或 pAdEasy-2质粒至电感受态的BJ5183细胞，条件如下（基本方案，第 8 步)。 2. 将转化混合物（通常 5 % 〜1 0 % ) 铺至含 5(V g/m I氨苄青霉素、 30jug/m l链霉素的 L B 琼脂糖板， 37°C培养 15〜20h。 3. 挑取 10〜20个克隆于2m l含氨苄青霉素、链霉素的L B 培养基， 37°C摇床培养过夜。 4 . 以任一个标准的碱裂解方法纯化各个克隆的质粒DNA。 5 . 限制酶（拓/1(111或尸对I ) 消化 2 0 % 〜3 0 % 小量制备的D N A 以确认质粒。选取一个经确认的克隆（指定为AdEasier-1或 AdEasier-2)用于后续试验。 6. 准备电感受态AdEasier细胞，除用含氨苄青霉素、链霉素的L B 培养基外，方法见支持方案3。 7 . 以 20^1/管储存电感受态AclEasier细胞，部分保存于一80°C ，可保存6 个月。转化时溶解一部分并置于冰上

8.克隆基因至穿梭载体，用 P m e 工消化（见基本方案，第 1〜5 步）。 9•每2〇4电感受态AdEasier细胞加 8^1用 I 消化的穿梭载体。限制终体积为 30M 。 10•将细菌/D N A 混合物小心转移至冰镇的2m m 电穿孔杯，避免泡沫形成并将之置于湿冰上。在 Bio-Rad Gene Pulser电穿孔仪上以2500V ， 20〇 n ， 25juFD的脉冲穿孔。 U •用5OOml L B 培养基重悬转化混合物。铺1〇%〜2 0 % 的转化混合物至1〜2 个 LB/卡那板， 37°C 培养过夜（16〜20h)。 12.挑1〇〜20个最小的克隆，每个用2m l含 25!ug/m l 卡那霉素的L B 培养基37°C 旋转培养10〜15h ，纯化、标记、重新生长质粒D N A ，见基本方案，第 11〜13步。在 293包装系生产重组腺病毒方法如前所述（基本方案，第 14〜24步）。支持方案1 制备并纯化高滴定度腺病毒大多数情况下，需要放大2〜4 个回合以达到大规模制备高滴定度腺病毒。然而回合数主要决定于初级转染溶胞产物的初始滴定度。附加材料（基本方案；标n /的条目参见附录1) 初级转染病毒上清（基本方案） CsCl 矿物油氯漂白剂 V 2X 储存缓冲液空白溶液：等体积混合的I.35g/ml CsCl与 2X 储存缓冲液 V T E 缓冲液，含〇.i%SDS (见个别处方） 75cm2 组织培养瓶 Benchtop离心机 5 0 m l 圆锥离心管 Sorvall低温离心机，有 H S -4转子 12m l 异质同晶聚合物管用于S W u Ti转子 Beckman (或相当产品）超离心机，有 S W 4 1 Ti转子站架、夹钳 3m l 吸管、 18G 注射针头回合 1 : 从初级转染溶胞产物放大 L 〜15h 8 0 % 〜 90■ 密度接种 2 9 3 细胞至 25cm 2 组织培养瓶（3 X 1〇6 个细胞 /瓶含 6ml D M E M ) 。 2• 每 »卩 3 0 % 〜5〇% _级转染病毒上清感染 2w 组织培养瓶中挪犠 = 染时初级转染溶胞产物的用量主要决定于其初始滴定度（通常为 i〇s〜 i〇8 感1 变效应或确买的细胞裂解会变得明显。高产量的感染应该可以通过观察 1 下的病毒溶胞产物储存于一赃或 ― 80。〇。感染后 2 〜p A d T M

based载体的 G F P 的表达检测到。 3. 在 3 0 % 〜5 0 % 的被感染细胞分离时（通常在感染后3〜5d) 刮下并收集细胞。 4. 转移刮下的细胞至15m l 圆锥离心管， 500心代离心 l〇 m in。去上清， 5m i培养基旋转重悬。 5 . 干冰/甲醇浴冷冻细胞， 37°C水浴解冻循环4 次以从细胞释放病毒。用清洁的溶胞产物进行下一回合的放大或一80°C保存（可达一年）。回合 2 和 3 : 中等规模的放大 6•感染前12〜15h 以 9 0 % 的密度接种293细胞至75c m2 组织培养瓶（5 X 106〜7X 106 个细胞/瓶含 16ml D M E M )。 7•每75c m2 组织培养瓶2阳个细胞加人2〜4m l 第 5 步制备的病毒溶胞产物。 37° C ， 5 % C O 2培养箱中培养。 8. 在 3 0 % 〜5 0 % 的被感染细胞分离时（通常在感染后2〜4d) 刮下并收集细胞。 9 . 转移刮下的细胞至50m l 圆锥离心管，在 benchtop临床离心机上500g ， 4°C离心 10m m 。去上清液， IOml培养基旋转重悬。干冰/甲醇浴冷冻细胞， 37〇c 水浴解冻循环 4 次以从细胞释放病毒。用清洁的溶胞产物进行下一回合（第三回合）的放大或一80°C保存。氯漂白剂灭毒含有病毒的废弃物。 10. 用 3〜5 个 75cm2 组织培养瓶重复第6〜9 步，进一步放大。收集被感染的细胞时，用 25m l 灭菌的P B S 或 H B S S 重悬。冰冻/溶解3 或 4 个循环释放细胞中的病毒。用清洁的溶胞产物进行下一回合的大规模的放大或一80°C 保存。 • 滴定度可以随时测定，在有 pAdTrack-based时更容易。用不同浓度的病毒上清感染 2 9 3 细胞， 18h 后计数表达 G F P 的细胞数。没有 AdTrack病毒可以斑点滴疋（支持方案 2) 或通过用标准方法限制浓度来滴定。放大 3 回合后，病毒滴度应该达到每毫升溶胞产物含 IO9〜101°个感染颗粒（或块状单位）。回合 4 : 大规模放大以及 C s C l 密度梯度离心纯化 11. 感染时9 0 % 〜1 0 0 % 的密度接种293细胞至15〜20个 75cm2 组织培养瓶（ IX lO 7 个细胞/瓶)。 12. 以 IOpfu/个细胞用病毒上清多重感染细胞。 13.当所有细胞变圆并且一半以上独立时（通常感染后3〜，从所有瓶中收获并混合细胞， benchtop离心机 500g 离心 5min，去上清。氯漂白剂灭毒含有病毒的废弃物。 14. 8m l 灭菌P B S 重悬细胞团。干冰/甲醇浴冷冻细胞， 37°C 水浴解冻循环4 次以从细胞释放病毒。低温离心机上7000心4°C 离心5min。 15. 称取4.蛣 CsCl于 50m l 圆锥离心管，转移 8m l 清洁的病毒上清至里面（避免成团），旋转充分混匀。 16•转移上述CsCl溶液（约 10ml， 1.35g/ml) 至一个12m l用于SW 41 Ti转子的异质同晶聚合物管。以 2m l 矿物油覆盖填充该管子，准备一个平衡管， I76 000^ 1〇 ^ 超速离心18〜24h。

和 15/xl空白溶液至 I0^ i T E /0.1 % S D S ，旋转 3〇s, 离心 5min，测量。 I O D 单位含有 I0I2个病毒颗粒 /ml ( 颗粒：感染颗粒 =2〇 : D 。将浓缩的病毒 f 种储存于 - 8 0 C 最好，因为病毒颗粒在高盐条件中更稳定。病毒原种在体外高度稀释应用时 ’经纯化的病毒制剂可以直接用。但在其他情况下，由于 CsCl 可能会产生干扰或产生细胞毒性，最好在应用之前立即去盐柱或琼脂糖管透析去盐（支持方案 5 ) 。支持方案2 腺病毒板块分析附加材料（基本方案；标V 的条目参见附录1) 腺病毒 2.8% (w /V ) Bacto 琼脂（ BectonDikinson) 2 X Basal Medium Eagle (B M E ； Life Technologies) lmol/L H E PES V I.Omol/L MgCl2 胎牛血清 100X 氨苄西林/链霉素溶液（如 Life Technologies) IOOX 中性红原料（ LifeTechnologies) 6 孔板 45°C水浴箱 1.以 5 0 % 〜7 0 % 的密度接种2 9 3 细胞至6 孔板_(2 X IO5〜5 X IO5 个细胞/孔含 5ml D M E M ) 0 2. 在 10〜50W 体系中，根据腺病毒滴度确定一个合适的6 个 10倍稀释范围（通常为 1(T 3〜K T 81Ul/孔）。充分准备每个梯度的量，以备复杂的分析所需。 3. 去除每个孔中的上清，加人2m l D M E M 。将前面制备的6 个浓度的腺病毒分别加人 6 个孔中感染6〜16h。每个孔都保留一个副本。 4 . 高压灭菌100ml 2. 8 % Bacto琼脂用作覆盖琼脂， 45°C水浴箱中保持温热。 5 . 如下制备I O O m l覆盖混合物（每 6 孔板需要25ml): 50. Oml 2X Basal M e d i u m Eagle (终浓度 I X ) ; 2. Oml lmol/L H E P E S (终浓度 20. O m m o l / L ) ; I. 25ml I. Omol/L M g C l 2 (终浓度 12. 5 m m o l / L ); 10. 0 胎牛血清（终浓度1〇%V A 〇; I.Oml 100X 氨苄青霉素/链霉素溶液（终浓度I X ); 充分混合，’ 37°C水浴箱中预热

36ml 2. 8 % Bacto 琼脂（终浓度 1. 0%) 充分混合， 37°C 水浴箱中旋动。 6. 从孔中吸走D M E M ，沿着孔边沿慢慢地加入4m l 预热的覆盖混合物，注意不要移动细胞。 7 . 室温下放置10〜20min，让覆盖混合物凝固。为避免覆盖混合物在板块形成以前凝固，加灭菌的P B S 或 H B S S 至孔之间的空间，用塑料包裹物包裹6 孔板。置于 37°C 培养。 8 . 第 5 天，在原有覆盖混合物上再加1.5m l每孔的覆盖混合物营养细胞并使其保持严格的单细胞层。放回37°C培养。 . 9. 第 9 天，制备含中性红的覆盖混合物， 50m l 覆盖混合物中力口人5(%1 I O O X 中性红，每孔2m l 此覆盖混合物覆盖。 10. 室温下放置lOmin，让覆盖混合物凝固。置于 37°C 培养。 11. 12〜20h 后，取出 6 孔板，灯下或光盒上从其底部观察单细胞层。计数每孔中的板块数，板块为一个青灰色圆形区，中央有一个颜色更深的红橙色单细胞层。 12. 计算两套6 孔板每个梯度的板块平均数。这个平均数决定腺病毒原种的滴度，以板块形成单位每毫升（ pfu/m D 表示。由于病毒编码G F P , 可通过在荧光显微镜下计数 G F P 焦点数来确定感染性单位的滴度。支持方案3 电能BJ5183细胞制备附加材料（基本方案；标V 的条目参见附录1) 7 1 ^ 培养基，含链霉素301 ^/1111 10% (V /V ) 灭菌甘油，冰镇 lOng/jul pAdEasy-1 质粒 DNA J LB琼脂糖板，含氨苄青霉素50jug/ml 50m l 圆锥离心管 250m l 灭菌离心管，（用于 I E C 离心机） I E C 离心机（或相当） 1.5m l 微离心管，一 80°C 预冷 1. 在 50m l圆锥离心管用新鲜BJ5183菌落或原种接种IOml含 3(Vg/ml链霉素L B 培养基， 37°C摇床培养过夜。 2 . 取 I m l 上述细胞，接种至IOOOml含 30/xg/m l 链霉素L B 培养基中，通气良好下37°C 摇床剧烈振动培养4〜6h ，直到A 55 q达到0.8。 3. 收集细胞至4 个 250m l 灭菌离心管，冰上接种1〜3h (接种时间越长，其能力越大）， 2600g ， 4°C 离心 lOmin。 4 . 去上清，重悬于IOOOml 1 0 % 冰镇的灭菌甘油以洗细胞团。将重悬的细胞以2500g ， 4°C 离心 20min。重复洗一次。 5. 倒出大部分上清，然后用移液管轻轻的吸出残留的上清，每个 250m l 灭菌离心管留 IOml左右。混合并转移细胞悬液至一 50m 丨离心管中， 2500g ， 4°C 离心 l〇 min。

6.去掉大部分上清，加4〇111110%冰镇的灭菌甘油重悬细胞， 250(^， 41：离心1〇1^11。 7•吸去上清，留 2m l 重悬细胞团。每个预冷的1.5m l 微离心管分装2(^1，保存于 ~80°C o 8.为验证其能力，加入 L O juI lOng/jul的 pAdEasy- 1 质粒 D N A 至2 〇4 制备好的 BJ5183 细胞。 . 9•转移细胞/DNA混合物至冰镇的2mm电转杯，在 Bio-Rad Gene Pulser上以 2500V ， 2000, 25/iFD 进行电穿孔。 10. —个 50m l 圆锥离心管中，加 Iml L B 培养基至细胞， 37°C 摇床培养1〜2h。 11. 在 L B 培养基中配制100与 1000倍的细胞浓度。铺 IOOjuI各个浓度的细胞至含氨苄青霉素50jug/m l 的 L B 琼脂糖板， 37°C 温箱中培养过夜（滴度应该大于108 克隆/^g DNA)。支持方案4 腺病毒D N A 的制备附加材料（见基本方案；标V 的条目参见附录1) 病毒溶胞产物或C s C l 密度梯度离心纯化病毒原种 1 0 % S D S 0 . 5 m o l / L E D T A 2 0 m g / m l P C R 级别蛋白酶 K (Life T e c h n o l o g i e s ) V 7. 5mol/仁乙酸亮丙瑞林铵 s e e D N A ( A m e r s h a m B i o s c i e n c e s ) P C - 8 ( F i s h e r ) 或 2 5 : 2 4 : I ( V / V A 0 苯酚/氯仿/异戊基乙醇（附录J 0 7 0 % 和 1 0 0 % 乙醇 5 5 ° C水浴箱 1 . 每 I O O j ^ l 病毒溶胞产物或I O ^ J C s C l 密度梯度离心纯化病毒原种，力卩 7//110% SDS， 3 4 0. 5mol/L E D T A ， 2〇4 20mg/ml蛋白酶K 。充分混合，在 55°C水浴箱温浴 3hD 9 5 ° C 热激 5 m i n 。 2 . 以去离子蒸溜水将病毒D N A 溶液总体积加至2004，然后加IOOjlJ 7. 5mol/L 乙酸亮丙瑞林铵、 2 4 s e e D N A 。 3. 30〇4 PC-8抽提两次混合物。转移上相至一个新的I.5m l 微离心管，避免取到界面物质。加 600|ul 100%乙醇。 4 . 以最大速度离心微离心管I O m i n , 使病毒D N A 沉淀。 7〇%乙醇洗两次， 5〇Jui 水溶解病毒D N A 。支持方案5 快速琼脂糖柱透析材料琼脂糖，分子生物学级 2m l 微离心管 200jul过滤器tip

1.在微波炉最高温度下熔化琼脂糖与去离子蒸馏水混合物，制备 1 % 的琼脂糖。 2•吸取I m l 熔化的琼脂糖至2m l 微离心管作一个透析柱装置。将一个斜削的吸头粘在柱子的最底部。 3 . 室温下静止lh，取出吸头。加 50jul去离子蒸馏水在孔中，保持凝胶湿润。 4°C 保存柱子。 4•透析时，去掉水，用注射针吸头加入病毒原种溶液.(一般小于25/iJ)。 5• —段时间后（通常 10〜20min)，用注射针吸头去掉病毒原种溶液，可以直接使用，如有必要可再重复透析一次。

来源：丁香实验

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