ELISPOT实验方法步骤详解

ELISPOT

1.      PBS溶解抗原为30 μg/ml，加100 μl/孔于PVDF膜铺底的96孔灭菌板过夜；

2.      第二天吸去包被液后，加5％FCS的PRMI 1640培养基100 μl封闭1小时，37 ^o C；

3.      准备脾细胞悬液（用氯化铵去除红细胞，制备成单个脾淋巴细胞悬液）；

4.      从1 × 10⁶ /孔开始，按1:3的稀释度开始逐孔稀释做不同浓度梯度，并做3个复孔，37 ^o C静置培养5小时；

5.      PBS洗3～5次，生物素化的抗鼠IgG二抗孵育30 min；

6.      PBS洗3～5次，链亲和素标记的碱性磷酸酶孵育30 min；

7.      PBS洗3～5次，用底物BCIP/NBT显色，显微镜下观察显色反应，显色后及时终止反应；

8.      计数每孔中的斑点数目，计算每10⁶ 个脾细胞中抗体分泌细胞数量。