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        【交流】载体构建时酶切位点选择及引物设计的相关问题

        丁香园论坛

        9658

        我想把目的基因连接到载体上,有几个问题想请教斑竹和各位战友:

        1、限制性内切酶的选择:我查看论坛说选择酶切位点需要考虑酶切位点在载体上的距离、酶切温度与连接效率、价格、使用频率等等。最后我综合价格、温度、Buffer选定XbaI和EcoRI,打算购买宝生的酶,相应的Buffer用附带的10×M Buffer。不知道我选择的酶切位点合适不合适呢?

        2、引物设计:引物结构为:保护碱基+酶切位点+目的基因末端

        上游引物5’-CCG TCTAGA ATGGCTTCGTACCCCTGC-3'

        下游引物5’-CCC GAATTC TCAGTTAGCCTCCCCCAT -3'

        不知道我这个引物设计得合不合理呢?

        我还有疑问到底要不要去除终止子TGA啊?如果不去除对后面的copGFP表达有没有影响?如果要去除,对读码框的影响要不要考虑? 我设计引物的时候没有去除终止密码子TGA,因为在copGFP前面还有一个EF1启动子驱动copGFP的表达,不知道我这样考虑对不对?


        附:

        【交流】载体构建时酶切位点选择及引物设计的相关问题

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