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        酶切法

        相关实验:总 DNA 质量检测及酶切实验

        最新修订时间:

        原理

        在pH值为8.0~8.3时,核酸分子碱基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电,在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物,在分子筛的作用下,使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异,从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料(如EB)后,在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。

        材料与仪器

        步骤

        1. 取10 μl DNA于0.8% 凝胶检测;

        2. 将DNA调节浓度至300-400 ng/
        μl

        3. 仔细阅读将所用的任何一种酶产品说明书,熟悉反应条件及酶切的贮存浓度(10U-50 U/
        μl)厂家配套试剂;

        4. 计算据反应条件所需要的各种试剂准确用量:(0.5 ml tube中)
        DNA(3-5 mM) 10
        μl
        buffer reaction ´10 1.5 μl
        Enzyme (15 U/μl) 0.8 μl(冰上)
        ddH2O 2.7
        μl
        混匀,短暂离心;

        5. 37 ℃ 温浴1-2 hrs (纯DNA) 或10 hrs(粗制DNA);

        6. 加入上样缓冲液终止酶切反应,也可65 ℃加热10 min使酶变性失活;

        7. 电泳检测酶切效率:
        每个样品取1/10量用琼脂糖电泳检测,制胶及点样方法同上。

        注意事项

        1.酶解不一定要过夜,不过反应时间越长所用的酶量就越少。与用酶解鉴定载体/插


        入片段相比,酶解基因组DNA所用酶浓度要高一些,一般1μg基因组DNA需加入5U内切酶。


        2.若电泳条带靠近加样孔的一端比另一端亮得多,表明酶切不完全。这可能是因为:①反应时间不够长(若反应过夜则可排除此项);②酶量不够或酶部分失活;③如果初始DNA样品溶于TE缓冲液中且在酶解反应中所占的体积较大时,TE缓冲液中的EDTA可能抑制酶解反应,这时可以用乙醇重新沉淀DNA,然后溶于少量TE缓冲液或SWD中。


        3.选用的DNA相对分子质量其涵盖的相对分子质量范围要大,如λHindⅢ可涵盖500bp到23kb的范围。


        4.DNA样品经消化后在各泳道中条带的亮度应一致,否则表明各样品浓度不一致。DNA浓度通常难以精确测定,可以通过调节上样体积来调节DNA的上样量。

        来源:丁香实验

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