零背景pTOPO-Blunt Simple平末端克隆试剂盒/

产品介绍：  

 本制品和传统的T4连接酶原理不同，它利用了Topoisomerase可以在瞬间（几秒钟-几分钟）、高效（接近100%）连接DNA片段的原理采用本公司独创的工艺制成。 
1. 平末端PCR产物不需要先加A，在瞬间（几秒钟-几分钟）完成平末端PCR产物连接。 
2. 特制的新型载体质粒大小仅仅不到2kb，充分发挥了TOPO载体越小，可容纳片段越大的优势，最大限度提高了大片段连接效率；连接后质粒大小比传统载体小2kb以上，质粒越小，转化效率越高，极大的提高了各种片段连接后的转化子数量。 
3. 采用氨苄抗性载体只需0-10分钟复苏时间，比卡那抗性载体1小时复苏时间缩短6倍。 
4. 最快可以省略1小时复苏步骤，热休克冰浴后，不用加LB复苏，直接将感受态涂板即可。从连接到涂板全程只需15分钟。
5. 自杀基因零背景原理，无自连假阳性，无需繁琐蓝白斑筛选和菌落PCR筛选。大部分情况下随机挑一个克隆便是有插入的（接近100%）。
6. 连接长片段能力远超传统Blunt克隆载体，可连接长达10kb片段（例如连接5kb片段，也可能达到挑10个菌落，至少8个是有插入的效果），是新一代世界领先的简单、快速、零背景免筛选的TOPO Blunt平末端克隆载体。
本制品在克隆插入位点两侧不含多克隆酶切位点（Simple），需要时可在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。此时如果使用PCR扩增引物导入的酶切位点进行酶切时，酶切反应将不会受到载体上其它多克隆酶切位点影响，可大大提高酶切效率，增加亚克隆成功率。
 试剂盒组成、储存、稳定性：

▲ 本 TOPO 载体连接体系按照 10 μl 一次计算可以用 20 次，如果按照其它公司产品5 μl 一次计算，使用次数可以增加一倍，20 次可用 40 次。
▲ -20°C 储存，至少 12 个月。冰袋运输，1-2 天置于室外常温不影响质量。

 操作步骤：
1. 连接反应的准备：
PCR引物使用正常设计的引物即可，不需做任何改变（不能用磷酸化引物）。使用扩增产物是平末端的高保真聚合酶系列扩增（如Pfu、Phusion、A8 Mix、A9 Mix）PCR产物一般建议胶回收纯化（货号：DR01)，这样可以避免后续可能的问题。如果PCR产物仅有目的条带、无非特异条带和引物二聚体，也可尝试直接进行连接反应。如果是以质粒为模板的PCR产物则最好进行纯化，因为模板质粒也可能长出菌落（但不是想构建的目的载体）。
2. 连接反应：
1) 室温设立 10 μl 连接体系（建议用 0.2 ml PCR 管，PCR 仪器控温）：纯化后的 PCR 产物/或者 1 μl 1 kb Control 0.5-5 μlpTOPO-Blunt Simple Vector 1 μl10 × Enhancer 1 μl
灭菌水 X μl总体积 10 μl加完试剂后，用移液器轻轻吹打混匀或者轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体在离心管底，注意此步骤不能在冰上进行，只能在室温（25°C-37°C）进行。
▲ 如果使用 5 μl 体系连接，各成分按照比例减半使用，使用次数可以加倍。不同大小插入片段的推荐用量（注意过量太多了，反而导致转化子减少）：插入片段大小（bp） 推荐用量（ng）100-1000 10-401000-2000 40-802000-5000 80-180
2) 37°C 连接 5 分钟（建议置 PCR 仪器上控温）。▲ 本载体推荐室温（25°C-37°C）5 分钟完成连接。长片段或者连接困难片段可以延长连接时间到 10-15 分钟，温度可选 37°C，可显著增加转化子数量。
3) 连接产物置于冰上备用。立即接标准的感受态转化步骤或快速转化步骤。
3. 快速转化：
1) 感受态细胞从-80°C 拿出，迅速插入冰浴中，解冻融化（约 1-3 分钟）。
2) 立刻加入 5 μl 连接液(最多可 10 μl 连接液全加入，只要体积不超过感受态细胞体积的 1/10)，手指拨打（Flick）离心管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰浴放置 5 分钟。
3) 热休克：42°C 水浴热休克 60 秒，迅速放回冰浴静置 2-3 分钟，该过程不要摇动离心管。
▲ 本公司技术连接效率比竞争对手高 10-100 倍，所以如果后续发现转化子很多，甚至长糊板子，做完热休克步骤后，可以省略步骤 4（复苏），直接将热休克冰浴后的感受态细胞涂板，培养过夜即可。这样从连接到涂板全过程仅需要 15分钟，超快速流程极大的简化了操作，缩短了时间。
4) 复苏（可选步骤）：加 500 μl LB 或者 SOC 培养基(不含抗生素)，37°C 200 rpm 振荡培养 10-20 分钟。
▲ 根据我们的经验，一般可以直接将培养基（如从冰箱取出温度低，应事先置37°C 温箱回温至 22°C-37°C） 加入到感受态细胞的 1.5 ml 离心管，盖上离心管盖，水平固定在振荡培养箱中振荡培养复苏即可，不需要转移到试管培养复苏。
▲ 一般商品化的感受态细胞不超过 2 kb 插入片段情况下，热休克后 10-15 分钟复苏可以得到足够多转化子，如果使用实验室自制的感受态效率低、或者转化子少、插入片段长的情况下可以提高复苏时间到 30-60 分钟以得到更多的转化子。
▲ 本公司技术连接效率比竞争对手高 10-100 倍，追求最简单最快速的用户可以尝试省略步骤 4（复苏）， 直接将热休克冰浴后的感受态细胞涂板，培养过夜即可。熟悉超快速流程后，以后这样从连接到涂板全过程仅需要 15 分钟，超快速流程极大的简化了操作，缩短了时间。
5) 取 100-200 μl 菌液涂板(培养板含氨苄西林 100 μg/ml），培养过夜。
4. 转化子的筛选鉴定：
 本制品采用自杀基因零背景原理，无插入自连的细菌会自杀无法生长，因此几乎没有假阳性，一般情况下，可以达到所见即所得，只要是长出来的菌落正常（不是污染的杂菌，转化子数量也不算太少），基本就 100%包含插入。因此插入片段不超过 2-3kb 的情况下强烈建议不做菌落 PCR 鉴定,直接挑 1-2 个菌去测序。
1). 一般本公司 TOPO 载体阳性率非常高，所以菌落生长正常，数量也不是太少的情况下建议直接去测序（强烈建议不做菌落 PCR 筛选）。注意测序引物不能采用 M13(-47)/M13(-48)通用引物测序。
2). TOPO 载体的菌落 PCR 结果容易出现假阴性（就是菌 P 失败显示没有插入或者扩增大小不对，实际却是有插入的）。因此在使用菌 P 鉴定的情况下，如菌 P 结果阳性，一般可以相信此结果。如结果是阴性，或者显示扩增出大小和预期不符合，一般不可相信，要考虑到菌 P 结果假阴性的可能，需要直接去测序鉴定，测序成功的完成实验；测序不成功的可以进一步提取质粒跑电泳看大小，或者酶切鉴定来确认。
3). 用上述培养的白色菌落的菌液抽提质粒，插入片段较大的情况下，直接跑电泳看质粒大小就直接能鉴定出有插入的质粒，还可用载体骨架上酶切位点如 ApaI/BglI/BsaHI，或者插入片段上引入的酶切位点酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳检查片段大小，确定是否含有目的片段。

 pTOPO-Blunt Simple 载体图谱：                                                                 

 pTOPO-BLUNT Simple 载体克隆位点序列：