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        质粒的分离与纯化

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          含质粒的E. Coli cells经LB培养液250ml扩大培养,倒入50ml离心管,4℃,3000rpm,离心15分钟。弃去上清液。(弃去液丢弃前应作消毒处理,以免污染环境)。加lysis buffer(50mmol/L Glucose,10mmol/l EDTA,25mmol/l Tris-HCl,pH8.0)1-2ml使之悬浮。放置室温5分钟,加3.5-7ml新配制SDS/NaOH溶液(1mol/l NaOH 8ml,20%SDs 2ml,蒸馏水30ml)上下摇匀,置冰水浴5分钟。禁用混匀器,以免DNA分子断裂),加2.5mol/L醋酸钾缓冲液(pH4.8)2.6-5.2ml,上下摇匀,冰浴5分钟。4℃,3000rpm,离心15分钟。沉淀蛋白质。取上清液,加无水乙醇12-24ml(上清液的二倍)放室温15分钟后,10000rpm离心,弃上清液。加约为沉淀物体积的0.4倍TE(10mmol/l Tris-Hcl pH8.0,10mmol/l EDTA)溶解沉淀后,加0.2倍的7.5mol/L醋酸铵。可用混匀器混匀,置冰浴10分钟。4℃,10000rpm离心5min,弃上清液。加沉淀物0.4倍的10mmol/l Tris-HCl pH7.5,10mmol/l EDTA缓冲液,1/10体积的5mg/ml RNase,37℃,30分钟保温。加等量的phenol(酚)/CIAA(480ml氯仿,20ml异戊醇),混匀。4℃,10000rpm,离心5分钟。取上层液加酚/CIAA重复一次。取上层液加1/10体积5mol/l NaCl和2倍无水乙醇,―20℃过夜或―70℃2小时以上。4℃,10000rpm,离心10分钟,弃上清液。加80%乙醇不摇动,直接10000rpm离心,弃上清液,真空干燥。加适量(约200μl)TE溶解。测定含量后备用。

         

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